El ácido palmitoleico como molécula coordinadora entre el nematodo invasor del pino y sus hongos recientemente asociados - Grupo Co., Ltd de ácidos grasos de Chongqing

The ISME Journal (2023)Cite este artículo

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Los microorganismos simbióticos están omnipresentes en la superficie del cuerpo o en los tejidos internos de los invertebrados, lo que les proporciona beneficios. El desarrollo de relaciones simbióticas requiere sincronización de las etapas de desarrollo y proximidad física de los socios. Por tanto, la identificación de metabolitos que coordinan la reproducción de socios simbióticos es esencial. Este estudio demuestra que el ácido palmitoleico (C16:1) coordina la propagación bilateral regulando la sincronización de la reproducción entre el nematodo invasor de la madera del pino (PWN) y su hongo de mancha azul recientemente asociado, Sporothrix sp.1. Cuando el PWN se alimentó de Sporothrix sp.1, hubo un aumento significativo en la expresión del gen del metabolismo de los lípidos y la abundancia de metabolitos. A través de investigaciones adicionales, se destacó una mejora significativa en la reproducción del PWN mediante la adquisición directa de C16: 1, que estaba presente en abundancia en Sporothrix sp.1. Además, el PWN biosintetizó C16: 1 mediante la participación del gen de la estearoil-CoA 9-desaturasa grasa-5 y su receptor nuclear hormonal nhr-80, que se aclaró para promover la capacidad de puesta de huevos de las hembras. Además, vale la pena señalar que la producción de C16:1 fue significativamente mayor por el hongo asociado Sporothrix sp.1 para mejorar la esporulación durante la fase de formación de esporas en comparación con la fase de crecimiento de hifas. Por lo tanto, al coordinar la fecundidad y la producción de esporas, el metabolito lipídico clave C16:1 facilita la colonización rápida y exitosa de una relación simbiótica mutuamente beneficiosa entre el PWN invasivo y el Sporothrix sp.1 nativo dentro del huésped. Este hallazgo enfatiza el papel importante del intercambio de metabolitos y su función en la promoción de la sincronización de socios dentro de las relaciones simbióticas.

Los microbios simbióticos están ampliamente distribuidos y se encuentran no sólo en la superficie del cuerpo sino también dentro del intestino y la cavidad sanguínea de los invertebrados asociados. Estos microbios proporcionan a los socios ingesta nutricional, crecimiento, desarrollo y resistencia a patógenos adicionales [1, 2]. Los estudios han informado que las bacterias asociadas sintetizan aminoácidos, fijan nitrógeno y degradan la celulosa, proporcionando nutrición y energía a sus socios simbióticos, como hormigas, pulgones y cucarachas [3,4,5,6]. Algunas bacterias simbióticas, como Pseudomonas y Streptomyces, también pueden producir toxinas policétidas y antibióticos para proteger a sus parejas de microbios patógenos y depredadores [7, 8]. En consecuencia, algunos insectos han desarrollado una variedad de estrategias para proteger, transportar y transmitir sus principales hongos asociados, como los mycangia [9, 10]. Estas interacciones microbios-invertebrados se han formado y persistido durante millones de años de evolución [11]. El establecimiento de una relación simbiótica requiere la coherencia del desarrollo de socios simbióticos que se superpongan en el tiempo y el espacio. Sin embargo, el foco principal de la investigación ha sido examinar relaciones simbióticas bien establecidas, y el proceso de establecimiento de nuevas relaciones simbióticas sigue siendo relativamente confuso.

De hecho, las especies invasoras frecuentemente exhiben la capacidad de establecer rápidamente nuevas asociaciones simbióticas con especies autóctonas, asumiendo así una función destacada en la mejora del efecto de cuello de botella que encuentran pequeñas poblaciones del invasor [1, 12]. Los microorganismos simbióticos sirven como socios adecuados para las especies invasoras y son un factor beneficioso para su colonización exitosa [13]. Por ejemplo, algunas plantas leñosas no pueden introducirse con éxito sin formar asociaciones ectomicorrízicas con hongos del suelo [14]. Por el contrario, los organismos invasores pueden acelerar su establecimiento si encuentran un nuevo socio simbiótico beneficioso en una región recién invadida [15, 16]. Por ejemplo, después de invadir China, el nematodo de la madera del pino (PWN), originario de América del Norte, formó rápidamente una nueva asociación simbiótica con el hongo autóctono de la mancha azul, Sporothrix sp.1. Esto mejoró la capacidad reproductiva del nematodo y facilitó su exitosa colonización en el nuevo entorno ecológico [17]. Además, los organismos invasores podrían promover aún más la propagación de hongos recientemente asociados en las regiones invadidas para ocupar un nicho ecológico importante [15, 16]. Se deben explorar los metabolitos que coordinan bilateralmente los ciclos de vida en el tiempo y el espacio de socios asociados cuando se produce una nueva interacción simbiótica.

Todo el ciclo patogénico del PWN se basa en complejas interacciones con sus socios simbióticos, especialmente los hongos simbióticos [18,19,20,21]. El PWN a menudo ingresa a nuevos pinos hospedantes sanos a través de las ramas jóvenes junto con microorganismos asociados, especialmente hongos ofiostomatoides de mancha azul. Posteriormente, estos hongos crecen y se propagan rápidamente a lo largo del tronco del pino, acelerando así la reproducción y migración del PWN desde la copa del árbol hasta la base del tronco. A medida que avanza la infestación, disminuye el suministro de nutrientes para el NMP en el pino. Las esporas de los hongos ofiostomatoides se convierten en la principal fuente de nutrición para la población de NMP y hacen que el xilema se vuelva azul [20,21,22]. Este estudio se centró en explorar el sistema invasivo simbiótico entre PWN y S. sp. 1. Nuestro objetivo era descubrir los metabolitos que coordinan las capacidades de reproducción y adaptabilidad de ambos organismos. El metabolito clave ácido palmitoleico (C16:1) se identificó con éxito mediante la aplicación de análisis genómicos, transcriptómicos y metabolómicos, junto con técnicas bioquímicas y de biología molecular. Este estudio es una expansión teórica de los metabolitos de nutrientes en el establecimiento de un nuevo sistema simbiótico del paradigma teórico de la invasión simbiótica. También proporciona un marco para el estudio de los metabolitos de los nutrientes y las características biológicas de la fertilidad mejorada.

El diagrama de flujo del diseño experimental en este estudio se muestra en la Fig. 1A. Se obtuvieron aislados de PWN de China (CNPWN) y América del Norte (USPWN) de Zhashui, Shaanxi, China y Pensilvania, EE. UU., respectivamente. Los aislados se cultivaron en agar extracto de malta (MEA) al 2% con dos hongos teñidos de azul a 25 °C. Los hongos se cultivaron en 2% de MEA a 25 °C y 80% de humedad durante una semana. S. sp. 1 es una especie local china de hongos de mancha azul del grupo de los ofiostomatoideos, mientras que Ophiostoma ips es una especie común tanto en China como en América del Norte. Los especímenes de vale se depositaron en la colección de cultivos (CMW) del Instituto de Biotecnología Agrícola y Forestal (FABI) de la Universidad de Pretoria, Sudáfrica. Se prepararon medio de suplementación con ácidos grasos y medio en polvo de xilema y se realizaron experimentos siguiendo los métodos suplementarios.

A El diagrama de diseño experimental. B Abundancia de CNPWN cultivado continuamente en dos hongos de mancha azul para las generaciones 0, 5, 20 y 40, y se inocularon 10 nematodos en cada placa, con 10 réplicas para cada tratamiento. *, **, **** representan diferencias significativas bajo p < 0,05, p < 0,01 y p < 0,0001 respectivamente [prueba t de Student]. C Se evaluó la tasa de mortalidad de NMP con dos hongos de mancha azul en Pinus thunbergii, aplicando un tratamiento a 10 árboles y 3 réplicas para cada tratamiento. * representa una diferencia significativa bajo p < 0,05 [prueba t de Student]. D Crecimiento poblacional de PWN en P. thunbergii, con 10 repeticiones para cada tratamiento. *** representan diferencias significativas bajo p < 0,001 respectivamente [prueba t de Student]. E Distribución de grupos funcionales KEGG dentro de genes regulados positivamente en PWN cultivados continuamente en Sporothrix. sp.1 y Ophiostoma ips durante 40 generación. F Red de coexpresión (r ≥ 0,8) de genes altamente expresados en S. sp. 1-PWN cultivados. Las líneas que conectan genes indican expresión correlacionada; anotaciones funcionales: involucrado en la reproducción (relleno de amarillo), proceso de metabolismo de los lípidos (relleno de naranja). G Vías del metabolismo de las grasas con genes utilizados en RT-qPCR. H Perfiles de expresión genética de genes en el metabolismo de los lípidos tratados con dos hongos teñidos de azul basados en RT-qPCR. [n = 5; *p < 0,05; **p < 0,01; ****p < 0,0001; Prueba t de Student].

Dos especies de hongos teñidos de azul, S. sp. 1 y O. ips, se cultivaron en MEA al 2%. Cada placa (90 mm de diámetro) se inoculó con 10 PWN (5 machos y 5 hembras) suspendidos en 40 μL de agua estéril, después de que los hongos hubieran crecido por toda la placa. Luego, los nematodos se incubaron a 25 °C en la oscuridad y se contaron en la generación 0, luego después de la 5, 20 y 40 generaciones utilizando el método del embudo de Baermann para medir los cambios en la fecundidad [23].

Se trasplantaron plántulas de Pinus thunbergii de dos a tres años de edad desde un área de campo a macetas en un invernadero (25 °C y 40% de humedad con un fotoperiodo de 10 L:14 D). Cada uno de los diez pinos fue inoculado con aproximadamente 1000 PWN cultivados en dos hongos de tinción azul, con tres réplicas por tratamiento [24]. Después de 20 días, se registró la proporción de plántulas de pino laricio marchitas y se determinó el número total de nematodos por plántula recolectando nematodos de pequeñas secciones del tronco utilizando el método del embudo de Baermann. El número de nematodos por gramo de peso seco de plántula se calculó en base a las astillas de madera secas. (n=10).

La extracción de ARN, el análisis de secuencia de ARN, la síntesis de ADNc y la qRT-PCR siguieron el protocolo descrito en los Métodos complementarios. La Tabla complementaria S1 contiene los cebadores utilizados en este estudio. Tanto las cepas CNPWN como las USPWN se cultivaron continuamente en colonias de cada uno de los dos hongos durante 40 generaciones. Los nematodos de 40.ª generación se prepararon combinando nematodos de etapa mixta. La secuenciación del transcriptoma y la qRT-PCR se realizaron en PWN suplementados con C16:1 y ácido oleico (C18:1) utilizando el protocolo descrito en los Métodos complementarios, con tres réplicas biológicas. Los datos de RNA-seq de PWN en diferentes etapas de la vida se obtuvieron de la base de datos SRA de NCBI (PRJNA798902) y se analizaron utilizando los mismos métodos que se describen en los Métodos complementarios.

Los lípidos se visualizaron tiñendo nematodos con Oil-Red O (Sigma, Missouri, EE. UU.) y hongos con Bodipy (D3922, Molecular Probes, Carlsbad, California, EE. UU.). Para garantizar que el número de hifas y células de hongos dentro del campo de visión fuera aproximadamente el mismo, se tiñeron imágenes de campo brillante y de núcleos celulares con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) fueron capturados por separado. Las muestras se recogieron y se lavaron dos o tres veces con solución salina tamponada con fosfato (1 x PBS) y se incubaron durante 2 h en solución Oil-Red O o Bodipy a temperatura ambiente. Después de dos o tres lavados con 1x PBS, las muestras se montaron en portaobjetos de vidrio. Los nematodos se examinaron mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) (Olympus, BX51) con un aumento de 10 ×. Los hongos se examinaron bajo un microscopio confocal Zeiss LSM 710 con un aumento de 63 × con una longitud de onda de excitación de 493 nm y una longitud de onda de emisión de 503 nm.

Los nematodos y hongos se homogeneizaron en 100 μl de 1 x PBS que contenía Tween-20 al 0,5% y se incubaron a 70 °C durante 5 minutos. A las muestras se les añadió reactivo de triglicéridos (Sigma) y se incubaron durante 30 min a 37 °C. Después de la centrifugación, las muestras se transfirieron a placas de 96 pocillos y se incubaron con reactivo de glicerol libre (Sigma) durante 5 minutos a 37 °C. Finalmente, las muestras se analizaron utilizando SpectraMax Plus384 a una longitud de onda de 540 nm.

Para investigar las diferencias en AF entre dos hongos con mancha azul y PWN tratados por estos hongos, utilizamos aproximadamente 5 mg de hongos o 10,000 nematodos. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y se molieron en una solución de H2SO4 al 2%/metanol al 98% (1 ml). Posteriormente, las muestras se sellaron con una tapa y se incubaron a 80 °C durante 1 h. Después de agregar 0,3 ml de hexano y 1,5 ml de H2O, los ésteres metílicos de ácidos grasos se extrajeron en la capa de hexano mediante agitación y luego se centrifugaron a 5000 x g durante 10 minutos. Analizamos las muestras de la fase orgánica utilizando un detector selectivo de masas (GC/MS) Agilent Technologies 6890 N GC-5973N. La espectrometría de masas se realizó según los métodos descritos en los Métodos complementarios.

Se cultivaron dos hongos teñidos de azul (S. sp. 1 y O. ips) en un medio MEA al 2% y agregamos diferentes tipos de FA descritos en los Métodos complementarios. Se inocularon diez PWN (machos: hembras = 5: 5) suspendidos en 40 μl de agua estéril en el medio de cada plato (12 réplicas) después de que los hongos hubieran crecido por todo el plato (60 mm de diámetro). Los nematodos se colocaron en una incubadora oscura a 25 °C durante una semana, utilizando el método de separación del embudo de Baermann para calcular el cambio en la fecundidad [23].

Para investigar la absorción de C16:0 y la biosíntesis de C16:1, se utilizó un isótopo estable de C16:0 (31D-C16:0). S. sp. 1 y O. ips se cultivaron en ME al 2 % (20 g de extracto de malta y 1 L de agua desionizada) al que se añadió 31D-C16:0 1 mM y detergente Tergitol al 0,1 % (tipo NP-40, Sigma-Aldrich) durante una semana. Los PWN se cultivaron en una placa de Petri con Botrytis cinerea. El ácido graso marcado se distribuyó uniformemente sobre la capa de hongos como se describe en los Métodos complementarios. La recolección, extracción y detección de PWN y sus FA también se describen en los Métodos complementarios. Los iones marcados son m/z: 301 para 31D-C16: 0 y 297 para 29D-C16: 1.

La síntesis de ARN bicatenario se realizó como se describió anteriormente. Brevemente, la PCR se realizó utilizando las muestras de ADNc como plantillas para generar fragmentos específicos de nhr-80 y fat-5 de 300 pb utilizando cebadores sentido y antisentido (Tabla S1) fusionados con secuencias promotoras del fago T7. La síntesis de ARNbc se logró mediante la transcripción simultánea de ambas cadenas de la plantilla mediante el sistema T7 RiboMAXTM Express RNAi (Promega, EE. UU.).

Los nematodos se recogieron y se lavaron con solución salina tamponada con fosfato con tampón Tween (1 x PBST). Para cada reacción, se empaparon alrededor de 10.000 nematodos en dsRNA en un volumen final de 50 μL. Las muestras de control se empaparon en ARNbc de proteína fluorescente verde (GFP). Para disolver los AG en la solución, se añadió Tergitol como se describió anteriormente. Todas las muestras empapadas se incubaron en un agitador orbital a 175 rpm, 20 °C durante 48 h. Después del remojo, los nematodos se lavaron tres veces con agua bidestilada. Los nematodos se clasificaron según el sexo y los experimentos continuaron hasta que no se pusieron más huevos. Se incubaron doce adultos (♀:♂ = 3:1) en pocillos de microtitulación que contenían 150 μL de ddH2O. Los huevos puestos se contaron a temperatura ambiente después de la incubación a 25 °C durante tres días (6 repeticiones).

Un análisis metabolómico comparativo de S. sp. 1 y O. ips se llevó a cabo para rastrear el origen de las FA en los PWN. Las extracciones de metabolitos, la detección por LC-MS/MS, el procesamiento de datos, la anotación de metabolitos y el enriquecimiento se realizaron como se describe en los Métodos complementarios. En este estudio se utilizaron seis réplicas biológicas.

Para investigar el efecto de los AG sobre el crecimiento y la fecundidad de los hongos, seleccionamos 1 mM de diferentes tipos de AG para evaluar el efecto sobre la tasa de crecimiento, el peso seco, la ramificación y la esporulación de los hongos. La preparación del medio y los experimentos se realizaron como se describe en los Métodos complementarios. Además, la diferencia de AG de S. sp. 1 entre la etapa de crecimiento de hifa (3 días después de la inoculación) y la etapa de formación de esporas (14 días después de la inoculación) se comparó utilizando GC/MS como se describe en los Métodos complementarios.

En este estudio, investigamos el efecto de dos hongos teñidos de azul, S. sp. 1 y O. ips, sobre la fecundidad de los PWN (S. sp. 1 + PWN y O. ips + PWN). Se cultivaron cepas de nematodos de China (CNPWN) y América del Norte (USPWN) en cada hongo durante varias generaciones. Nuestro hallazgo demostró que S. sp. 1 tiene un efecto positivo significativo sobre la fecundidad de los PWN en comparación con O. ips, y este efecto aumenta con el número de generaciones en cultivo.

Para los CNPWN, el número de PWN por placa de Petri cultivada en O. ips en las generaciones 0, 5, 20 y 40 fue 2771, 2117, 2435 y 2310, respectivamente. Sin embargo, el número de PWN por placa de Petri cultivada en S. sp. 1 fueron 2850, 3572, 3950 y 8655, respectivamente. El análisis estadístico reveló diferencias significativas entre los dos grupos (quinta generación: gl = 9,0, t = 2,5, p < 0,05; vigésima generación: gl = 13,4, t = 3,7, p < 0,01; 40ª generación: gl = 9,2, t = 6,5 , p < 0,0001) (Fig. 1B). De manera similar, para los USPWN, el número de PWN por placa de Petri cultivada en O. ips fue 1815, 1810, 1995 y 2015, respectivamente, mientras que para S. sp. 1 + PWN, el número de PWN era 2550, 3050, 3300 y 6000, respectivamente. El análisis estadístico reveló diferencias significativas entre los dos grupos (0.ª generación: df = 14,0, t = 2,2, p < 0,05; 5.ª generación: df = 11,7, t = 3,5, p < 0,01; 20.ª generación: df = 18, t = 2,3 , p < 0,05; 40.ª generación: gl = 18, t = 6,0, p < 0,0001) (Fig. S1).

En este estudio, investigamos el impacto del cultivo continuo de PWN en diferentes hongos sobre su patogenicidad. Después de 40 generaciones de cultivo continuo en un medio inoculado con S. sp. 1, los PWN exhibieron una tasa de marchitamiento del 91,67% en plántulas de pino. Por el contrario, después de 40 generaciones de cultivo continuo en un medio de O. ips, el PWN mostró una tasa de marchitez del 62,5% en plántulas de pino (df = 3,2, t = 3,5, p <0,05) (Fig. 1C). Además, los PWN cultivados en S. sp. 1 y se propagó en plántulas de pino durante 2912,9 posgeneraciones producidas, mientras que el PWN cultivado en O. ips produjo 1599,6 descendientes (df = 17,7, t = 4,5, p <0,001) (Fig. 1D). Estos resultados demuestran que S. sp. 1 puede aumentar tanto la fertilidad como la patogenicidad de los PWN dentro del huésped P. thunbergii.

En este estudio, analizamos el impacto de S. sp. 1 sobre la expresión genética de PWN. Observamos que el tratamiento de CNPWN con S. sp. 1 resultó en 170 genes regulados positivamente (S. sp. 1 > O. ips) y 212 genes regulados negativamente (S. sp. 1 < O. ips); de manera similar, el tratamiento USPWN con S. sp. 1 resultó en 440 genes regulados positivamente (S. sp. 1> O. ips) y 197 genes regulados negativamente (S. sp. 1

La reproducción y la nutrición están estrechamente relacionadas. El suministro de nutrientes juega un papel vital en el suministro de energía para la reproducción. Los organismos en proceso de reproducción también pueden movilizar la energía almacenada para mejorar la eficiencia metabólica. Para explorar los factores subyacentes responsables del aumento de la patogenicidad de PWN, realizamos un análisis de coexpresión positiva de estos genes diferenciales y encontramos correlaciones positivas muy similares en los perfiles de expresión de genes relacionados con la reproducción y el metabolismo de los lípidos en S. sp. CNPWN y USPWN tratados con 1 (Fig. 1F). Por lo tanto, nuestros hallazgos sugieren que S. sp. 1 puede aumentar la fecundidad de PWN mediante la regulación positiva de los genes metabólicos de los lípidos.

Para comprender mejor el impacto de S. sp. 1 sobre la fecundidad de PWN e identificar genes o compuestos esenciales involucrados, realizamos una búsqueda genómica para identificar genes de PWN asociados con el metabolismo de los lípidos (Fig. 1G). Al igual que C. elegans, los PWN contienen diferentes clases de lípidos, como TAG, FA y fosfolípidos, y poseen genes implicados en la síntesis y degradación de estos lípidos. En particular, a diferencia de C. elegans, los PWN tienen solo un gen de desaturasa de ácido graso delta-9, grasa-5, mientras que C. elegans tiene tres, grasa-5, grasa-6 y grasa-7 [25]. Además, los PWN carecen del gen desaturasa de ácidos grasos omega-3, grasa-1 [26]. De manera similar, a diferencia de C. elegans, que tiene un solo gen para la grasa-2 que inicia la conversión de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), los PWN tienen tres de esos genes, grasa-2.1, grasa-2.2 y grasa-2.2. 2.3 [27]. El análisis RT-qPCR reveló que S. sp. 1 tratado con PWN mostró una expresión significativamente menor de grasa-5, que se redujo 0,09 veces en comparación con el PWN tratado con O. ips (df = 4,0, t = -7,3, p <0,01). Además, los niveles de expresión de grasa-2.2 y grasa-2.3 aumentaron 7,52 y 6,02 veces en comparación con los controles, respectivamente, lo cual fue estadísticamente significativo (df = 5,0, t = 8,0, p <0,0001; df = 4,2, t = 7,6, p < 0,01) (Fig. 1H). En conjunto, estos resultados sugieren que los AG, especialmente los MUFA o sus genes relacionados, pueden ser cruciales para la capacidad reproductiva de S. sp. 1 PWN tratados.

Los lípidos se almacenan principalmente en LD en forma de TAG desde nematodos hasta mamíferos. Este estudio comparó el contenido de lípidos tiñendo LD con rojo aceite y midiendo TAG. Los resultados de la tinción con LD demostraron una mayor densidad de LD en PWN cultivados con S. sp. 1 que O. ips (Fig. 2A). En consecuencia, los PWN cultivados en S. sp. 1 exhibió un contenido relativo de TAG aproximadamente cuatro veces mayor en comparación con los PWN cultivados en O. ips sin importar CNPWN y USPWN (df = 5,0, t = 2,7, p <0,05; df = 5,2, t = 2,5, p <0,05) (Fig. 2B). Estos hallazgos sugieren que los PWN cultivados en S. sp. Es posible que haya recibido más energía para diversas actividades biológicas como resultado de una mayor acumulación de lípidos.

A Contenido de grasa visualizado mediante tinción con aceite-Rojo-O. Los nematodos se cultivaron y trataron como se describe en Materiales y métodos. La tinción se realizó en nematodos hembra y se fotografió con un microscopio DIC. El rojo indica lípidos. B Los niveles relativos de TAG entre dos hongos teñidos de azul cultivados CNPWN y USPWN. [n = 5; *p < 0,05; Prueba t de Student]. C Los niveles relativos de ácidos grasos entre dos hongos teñidos de azul cultivados CNPWN [n = 6; *p < 0,05; ****p < 0,0001; Prueba t de Student]. D Fecundidad de PWN en las diferentes suplementaciones de ácidos grasos (n = 12). Las etiquetas con letras diferentes son significativamente diferentes en p < 0,05 (ANOVA, prueba de comparación múltiple de Tukey).

Además, determinamos la composición de FFA de PWN cultivados en dos hongos teñidos de azul mediante GC/MS, y descubrimos que estaba compuesta principalmente de SFA (C16: 0 y ácido esteárico: C18: 0), MUFA (C16: 1 y C18 : 1), y PUFA (ácido linoleico: C18: 2). Los CNPWN cultivados en S. sp. 1 tenía niveles más altos de FFA, especialmente C16: 1 y C18: 1, con aumentos de 1,4 y 3,9 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de control (df = 10, t = 2,5, p < 0,05; gl = 10, t = 6,9, p < 0,0001) (Fig. 2C). Además, los niveles de C16:1 son 1,7 veces superiores a los de los USPWN cultivados en S. sp. 1 en comparación con el grupo de control (df = 7,7, t = 3,4, p <0,05) (Fig. S3). En particular, en la sección anterior, encontramos que la expresión de grasa-5, que codifica la síntesis de MUFA, estaba regulada negativamente en PWN cultivados en S. sp. 1, mientras que la expresión de grasa-2.2 y grasa-2.3, que participan en la conversión de MUFA en PUFA, se reguló positivamente (Fig. 1G). Estos resultados sugieren que los altos niveles de MUFA en S. sp. Los PWN cultivados no pueden atribuirse a la biosíntesis sino a la ingesta de alimentos u otras rutas.

Para investigar el papel potencial de las AG en la mejora de la fertilidad de PWN, agregamos varios tipos de AG al medio de dos hongos. Los resultados de nuestra investigación demuestran que la adición de C16:1 en S. sp. 1 aumentó el número de PWN de 1825 a 2779 por placa de Petri; De manera similar, la adición de C16:1 en O. ips aumentó el número de PWN de 354,2 a 616,7 (PWN+S. sp. 1: F8, 99 = 14,9, p < 0,05; PWN+O. ips: F8, 99 = 62,7 , p < 0,05 ANOVA, prueba de Tukey) (Fig. 2D). Estos resultados indican que la suplementación con C16:1 mejora la fecundidad de PWN.

Además de la adquisición dietética, la síntesis de novo es una forma importante de adquirir AG. Para investigar más a fondo el papel de C16: 1 en la reproducción de PWN, comparamos los perfiles de expresión de genes del metabolismo de lípidos en PWN en diferentes etapas de la vida. Encontramos que la mayoría de los genes del metabolismo de los lípidos se expresan altamente en la etapa larvaria, pero dgat-2 y el receptor de hormona nuclear nhr-80, que están asociados con el contenido de TAG y MUFA, respectivamente, se expresan altamente en las etapas adultas, particularmente en las hembras. Figura 3A). Se ha demostrado que la grasa-5 es un objetivo clave de nhr-80 en C.elegans, que es homólogo al hnf-4 de los mamíferos, y puede regular la desaturación de SFA a MUFA modulando la expresión de fat-5 [28, 29]. Descubrimos que la región promotora del gen fat-5 en PWN contiene el supuesto dominio de unión a HNF4 CAAAGTCCA (Tabla S2, Fig. S4A). Además, comparamos la expresión de nhr-80 y fat-5 entre hombres y mujeres usando qRT-PCR y encontramos que el nivel de expresión de nhr-80 en hombres es 0,68 del de las mujeres (df = 7, t = 3,0, p <0,05) y la grasa-5 en los hombres es 0,46 de la de las mujeres (df = 8, t = 7,0, p <0,0001) (Fig. S4B). El contenido de C16: 1 de los PWN femeninos y masculinos se determinó adicionalmente mediante análisis GC/MS, revelando una mayor concentración de C16: 1 en los PWN femeninos (Fig. S4C). Estos hallazgos indican que la expresión genética implicada en la biosíntesis de C16:1 es más activa en nematodos hembras, lo que sugiere su posible implicación en el proceso reproductivo de los PWN.

A Patrones de expresión de genes del metabolismo de los lípidos en diferentes etapas de la vida de PWN. B Biosíntesis y absorción de C16:1 por PWN. Detección de C16: 0 y C16: 1 de PWN mediante GC/MS añadido con C16: 0 o C16: 1. C Biosíntesis de C16: 1 por PWN. Detección de C16: 1 marcado con 29D (m/z 298,6) mediante GC/MS en PWN alimentados con C16: 0 marcado con 31D (m/z 301,6). D C16 relativo: 1 niveles de PWN después de RNAi remojando dsnhr-80, dsfat-5 y dsGFP (control) (n = 6). **p < 0,01; ****p < 0,0001; Prueba t de Student. E La fecundidad se evaluó siguiendo el ARNi de PWN masculinos y femeninos (6 replicaciones) mediante remojo con dsnhr-80 y dsGFP (control) por separado. ****p < 0,0001; Prueba t de Student. F La fecundidad se evaluó siguiendo el ARNi de PWN masculinos y femeninos (6 replicaciones) mediante remojo con dsfat-5 y dsGFP (control) por separado. **p < 0,01; Prueba t de Student. G Distribución de grupos funcionales GO dentro de genes regulados positivamente en PWN tratados con C16: 1, ajuste de p <0,05. H Patrones de expresión de genes de la vía de señalización del receptor de insulina tratados con S. sp. 1 y O. ips de PWN basado en RT-qPCR. I Patrones de expresión de genes de la vía de señalización del receptor de insulina tratados con C16:1 y C18:1 de PWN basados en RT-qPCR.

Para confirmar la capacidad de PWN para obtener MUFA mediante alimentación directa y biosíntesis, el presente estudio complementó los medios con C16: 0 y C16: 1 para cultivar PWN. Específicamente, los PWN suplementados con C16:1 mostraron un aumento significativo en su contenido de C16:1. Además, los PWN alimentados con C16:0 pudieron producir C16:1 adicional (Fig. 3B).

Para proporcionar evidencia adicional de la capacidad de los PWN para producir C16: 1, etiquetamos 31D-C16: 0 y evaluamos si la etiqueta estaba integrada en C16: 1. El análisis GC/MS reveló la presencia de 29D-C16: 1 en los PWN ( Figura 3C).

Ya quedó demostrada la capacidad de PWN para convertir C16:1 mediante biosíntesis y la alta expresión de estos genes en hembras. Para explorar más a fondo cómo están involucrados los compuestos grasos, realizamos ARNi de nhr-80 y fat-5 en PWN. Nuestros resultados mostraron que tanto la eliminación de nhr-80 como de fat-5 redujeron la expresión de fat-5 y la cantidad relativa de C16: 1 en nematodos (Fig.3D y S5). En particular, el tratamiento con ARNi tuvo efectos específicos del sexo en la producción de huevos de PWN. Para nhr-80, la producción media de huevos de PWN tanto para machos como para hembras tratados con dsGFP fue de 41,5. Sin embargo, cuando solo los machos fueron tratados con dsnhr-80, la producción media de huevos se redujo a 34 (df = 10, t = 2,1, p = 0,06), mientras que para las hembras tratadas con dsnhr-80, la producción de huevos disminuyó aún más a 23,5 ( gl = 10, t = 7,1, p <0,0001) (Fig. 3E). Para fat-5, el número medio de huevos puestos por PWN tratados con dsGFP fue 41. Sin embargo, para los machos tratados con dsfat-5, el número medio disminuyó a 36,7 (df = 10, t = 1,3, p = 0,238), y para las mujeres tratadas con PWN, se redujo a 25,7 (df = 10, t = 3,5, p <0,01) (Fig. 3F). Estos hallazgos sugieren que el gen fat-5 regula la conversión de C16:1 y la fecundidad de las hembras PWN y está regulado por nhr-80.

Para obtener una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares subyacentes a la fecundidad mejorada de PWN por C16: 1, realizamos la secuenciación del transcriptoma en PWN tratados con C16: 1 y C18: 1. Nuestros resultados indicaron que los PWN tratados con C16: 1 exhibieron regulación positiva y enriquecimiento de genes asociados con el catabolismo de lípidos, el envejecimiento y la vía de señalización del receptor de insulina (Fig. 3G). Por el contrario, las vías antes mencionadas no fueron activadas por el tratamiento con C18: 1 (Fig. S6). Además, validamos la regulación positiva de genes asociados con la vía de señalización del receptor de insulina mediante RT-qPCR en PWN tratados con dos hongos diferentes durante 40 generaciones, así como en PWN tratados con dos MUFA diferentes. Estos resultados mostraron que tanto S. sp. 1 y C16: 1 fueron capaces de regular positivamente genes relacionados con la vía de señalización del receptor de insulina (Fig. 3H, I).

Investigar las razones del mayor contenido de lípidos en S. sp. 1 tratados con PWN que en los tratados con O. ips, y para determinar por qué S. sp. 1 es un mejor socio simbiótico que O. ips, realizamos un análisis metabolómico de los metabolitos de los dos hongos. Utilizando análisis de anotación y enriquecimiento de metabolitos diferenciales, observamos que los lípidos, ácidos nucleicos, péptidos, fitoquímicos, vitaminas y cofactores, que son esenciales para el crecimiento y desarrollo de los organismos, eran las principales categorías de metabolitos producidos por S. sp. 1 (aumentado en comparación con O. ips) (Fig. 4A). En particular, dos MUFA, C16:1 y C18:1, fueron abundantes en S. sp. 1. Por el contrario, O. ips tenía un alto contenido de compuestos con actividad insecticida, como la atrazina, que puede matar nematodos [30], y se descubrió que algunos alcaloides, incluido el tricoteceno, eran ingredientes activos en sustancias de origen vegetal con actividad nematicida. (Figura S7) [31]. Las interacciones interespecíficas entre especies simbióticas nativas y especies exóticas invasoras son uno de los factores más críticos para determinar la colonización exitosa de especies exóticas invasoras. En concreto, la especie de hongo S. sp. 1 proporciona a los NMP nutrientes de calidad relativamente alta, mientras que O. ips produce compuestos que pueden ser perjudiciales para los NMP.

Un análisis del enriquecimiento de metabolitos de regulación positiva por S. sp. 1. B Acumulación de lípidos de dos hongos teñidos de azul. Los micelios y conidios se tiñeron con BODIPY y DAPI (verde: BODIPY, azul: DAPI). C Los niveles relativos de TAG entre dos hongos teñidos de azul. [n = 5; ***p < 0,001; Prueba t de Student]. D Los niveles relativos de ácidos grasos libres entre dos hongos teñidos de azul. [n = 5; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; Prueba t de Student]. E Biosíntesis de C16: 1 por S .sp. 1 y O. ips. Detección de C16: 1 marcado con 29D (m/z 298,6) mediante GC/MS en hongos a los que se añadió C16: 0 marcado con 31D (m/z 301,6). El etiquetado con deuterio aumenta ligeramente el tiempo de retención del C16:1 relevante.

Los hongos se sometieron a una solución de tinción BODIPY para teñir los TAG en su micelio y conidios. Se observó fluorescencia verde brillante bajo el microscopio de barrido confocal láser, punteando las células del micelio y los conidios. Los núcleos se tiñeron de azul brillante con DAPI. El micelio fue fotografiado usando campo brillante. Se seleccionó para la fotografía un campo de visión con números de células similares y se observó la fluorescencia verde de S. sp. 1 estaba densamente distribuido en el campo, lo que indica su alto contenido de grasa (Fig. 4B). La medición del contenido de TAG de los dos hongos reveló que S. sp. 1 tenía un contenido de TAG aproximadamente dos veces mayor que el de O. ips (df = 8, t = -6,0, p <0,0001) (Fig. 4C).

Además, al utilizar GC/MS para determinar el contenido de AG de los dos hongos teñidos de azul, identificamos una variedad de SFA con longitudes de C16 a C24, incluidos C16: 0, C18: 0, ácido eicosanoico (C20: 0), ácido docosanoico (C22:0), y ácido lignico (C24:0); Los MUFA fueron C16:1 y C18:1; Los AGPI fueron ácido hexadecanoico (C16:2), C18:2 y ácido linolénico (C18:3). Los contenidos relativos de C16: 0, C18: 0, C16: 1, C18: 1 y C18: 2 en S. sp. 1 fueron 1,81, 1,25, 3,38, 4,52 y 1,45 veces mayores que los de O. ips, respectivamente (df = 7, t = 24,1, p < 0,001; gl = 7, t = 5,6, p < 0,01; gl = 4,9 , t = 3,1, p < 0,05; gl = 7, t = 8,1, p < 0,001; gl = 7, t = 2,9, p < 0,05;), siendo C16:1 y C18:1 particularmente abundantes (Fig. 4D ). Para eliminar cualquier sesgo introducido por los medios artificiales sobre el contenido de ácidos grasos de los hongos, preparamos un medio en polvo de xilema de pino para cultivar los hongos teñidos de azul. Los resultados mostraron que S. sp. 1-cultivado en medio de polvo de xilema contenía 3,54 veces más C16: 1 que O. ips (df = 10, t = 5,208, p <0,0001) (Fig. S8).

Esporotrix. sp. 1 como nuevo hongo simbiótico para los PWN, proporcionó más C16: 1 para los PWN, lo que puede promover significativamente la fecundidad. Esto sugiere que la capacidad de los hongos simbióticos para producir C16: 1 juega un papel crucial en la invasión exitosa de PWN en China. Para confirmar que S. sp. 1 tiene una mayor capacidad para producir C16:1, cultivamos dos hongos de tinción azul en ME suplementado con 31D-C16:0 y examinamos si la etiqueta estaba incorporada en C16:1. Los resultados indicaron que 29D-C16:1 estaba presente en ambos hongos, pero se encontró en mayor abundancia en S. sp. 1 (figura 4E).

Los AG son nutrientes cruciales para la supervivencia de los hongos. Para investigar los efectos de varios AG sobre el crecimiento y desarrollo de hongos de mancha azul en el sistema de simbiosis mutualista PWN-hongos, utilizamos la tasa de crecimiento micelial y el peso seco de los hongos como criterios para medir el crecimiento y desarrollo de los hongos. Nuestros resultados mostraron que en S. sp. 1-tratados con C16:1, la tasa de crecimiento micelial fue sólo del 68,13% del grupo control (df = 94,2, t = 10,4, p < 0,0001). En O. ips tratado con C16:1, la tasa de crecimiento micelial fue solo del 50,47% del grupo control (df = 103,2, t = 27,6, p < 0,0001). Si bien no tiene ningún efecto significativo sobre el peso seco de los hongos (Fig. 5A, B).

A Efectos de los ácidos grasos sobre el crecimiento de S. sp. 1 y O. ips, CK significa control. [n = 9; ****p < 0,0001; Prueba t de Student]. B Efectos de los ácidos grasos sobre el peso seco de S. sp. 1 y O. ips (n = 9), CK significa control, NS significa sin significancia. C Inducción de ramificación hifal por C16: 1, CK significa control. D Efectos de los ácidos grasos sobre el peso seco de esporas de S. sp. 1, CK significa control (n = 3). Las etiquetas con letras diferentes son significativamente diferentes en p < 0,05 (ANOVA, prueba de comparación múltiple de Tukey). E Efectos de los ácidos grasos sobre la esporulación de S. sp. 1 (n = 15). Las etiquetas con letras diferentes son significativamente diferentes en p < 0,05 (ANOVA, prueba de comparación múltiple de Tukey). F Los niveles relativos de ácidos grasos entre las diferentes etapas de vida de S. sp. 1 (n = 4). **, *** representan diferencias significativas bajo p < 0,01, p < 0,001 respectivamente [prueba t de Student].

Posteriormente, utilizamos el método del disco de papel para investigar el impacto de los FA en la ramificación micelial de dos hongos teñidos de azul y descubrimos que C16: 1 promueve la ramificación micelial de los hongos (Fig. 5C, S9). Además, C16:1 promovió la producción de más esporas por parte de los hongos. El peso seco de esporas en el tratamiento C16:1 fue de 2,23 mg, en comparación con 0,3 mg en el grupo control (F8, 18 = 3,6, p < 0,05). El número de esporas en el tratamiento C16:1 fue 9,06 × 106, mientras que en el grupo control fue 4,79 × 106 (F8, 126 = 628,2, p < 0,05) (Fig. 5D, E). El ciclo de vida de los hongos abarca la etapa de crecimiento de hifas y la etapa de formación de esporas. Durante el crecimiento de las hifas, los hongos absorben más nutrientes, mientras que la formación de esporas facilita la reproducción y diseminación de los hongos. También examinamos la composición de AG de S. sp. 1 en diferentes etapas de la vida. El nivel de C16:1 durante la etapa de formación de esporas fue 5,4 veces mayor que durante la etapa de crecimiento de hifas (df = 6, t = -8,344, p < 0,001) (Fig. 5F). Los resultados mostraron que el efecto positivo de C16:1 sobre la capacidad reproductiva se amplifica aún más a través de un circuito de retroalimentación positiva, con las etapas reproductivas produciendo y acumulando C16:1, lo que, a su vez, conduce a una mayor mejora de la capacidad reproductiva.

Se descubrió que los metabolitos actúan como "puentes moleculares" que facilitan la coordinación de relaciones simbióticas y el mantenimiento de la homeostasis. En la interacción simbiótica entre PWN y hongos, los lípidos C16:1 producidos por el hongo juegan un papel crucial en la mejora de la fecundidad y las capacidades de esporulación de ambos socios asociados, respectivamente, facilitando así el establecimiento de una relación simbiótica. PWN utiliza C16: 1 sintetizado por S. sp. 1 y PWN para aumentar la fecundidad y expandir las poblaciones. Con los pinos huéspedes debilitados, faltaban nutrientes suficientes. El hongo de la mancha azul podría aumentar sus posibilidades de supervivencia al producir esporas. El xilema teñido de azul con S. sp. 1 se convirtieron posteriormente en los principales nutrientes de PWN. Los ácidos grasos han sido identificados como importantes moléculas de señalización en muchas relaciones simbióticas. Para las plantas y los hongos micorrízicos arbusculares simbióticos, los AG son sustratos energéticos esenciales en la evolución de sistemas simbióticos mutuamente beneficiosos durante el proceso de terrestrialización de las plantas [32]. Sin embargo, las plantas deben depender de proteínas de transporte de membrana específicas para convertir eficazmente los AG en glicerol acilado y transportarlos al hongo para mantener su relación simbiótica [33]. Por el contrario, los animales pueden adquirir AG de sus socios simbióticos simplemente consumiéndolos. El metabolito lipídico clave C16: 1 desempeña un papel crucial a la hora de facilitar la rápida colonización exitosa de una relación simbiótica mutuamente beneficiosa entre el PWN invasor y el nativo S. sp. 1. dentro del anfitrión. Destaca la importancia de compartir eficientemente los metabolitos y sus funciones para promover la sincronización de socios en relaciones simbióticas.

Comprender la colonización de las relaciones simbióticas en los rangos introducidos es crucial para comprender la colonización y el brote de especies invasoras. Nuestra investigación reveló que cuando se introduce el PWN, utiliza rápidamente los recursos metabólicos de los hongos ofiostomatoides nativos, S. sp. 1. Esta utilización permite al PWN superar rápidamente el cuello de botella de una población pequeña al mejorar significativamente su capacidad reproductiva. Estos metabolitos mediaron la coordinación y comunicación entre los socios simbióticos. La capacidad de los microorganismos simbióticos para conferir nuevos rasgos a sus compañeros también se ha observado en otras especies invasoras. Por ejemplo, los microorganismos del suelo en el hábitat nativo del aciano europeo inhiben su crecimiento y limitan su expansión. Sin embargo, cuando este aciano invade América del Norte y establece una relación simbiótica con nuevos microorganismos del suelo, estos microorganismos promueven su crecimiento y desarrollo [34]. Por lo tanto, estudiar los metabolitos clave involucrados en estas relaciones simbióticas es una nueva dirección y una nueva visión para dilucidar el establecimiento y la propagación de especies invasoras.

En este estudio, presentamos evidencia de que C16: 1 juega un papel importante en la mejora de la reproducción. Aunque los efectos positivos de los MUFA sobre las enfermedades y el envejecimiento se han investigado ampliamente [35], nuestros hallazgos resaltan un papel novedoso para ellos en la mejora de la capacidad reproductiva. En concreto, observamos que la suplementación de C16:1 promueve la esporulación por S. sp. 1 y reproducción por PWN. Para S. sp. 1, C16: 1 produciendo y acumulándose durante la fase de formación de esporas en comparación con la etapa de crecimiento de hifas. Para PWN, la regulación positiva de nhr-80 y fat-5 en mujeres promueve la biosíntesis de C16: 1. Además, nuestros hallazgos sugieren que C16: 1 puede promover la fecundidad de los nematodos al mejorar la regulación de la vía de señalización de la insulina por parte de PWN. También se ha informado que C16: 1 mejora la sensibilidad a la insulina en humanos, y se ha demostrado que la vía de señalización de la insulina regula la capacidad reproductiva de apareamiento, la producción de óvulos y el desarrollo ovárico de los organismos [36, 37]. La función de los MUFA a la hora de generar descendencia podría conservarse en los organismos y merece una mayor investigación.

Los resultados de nuestro estudio respaldan aún más la idea de que "eres lo que comes". Se indica que la calidad nutricional de la fuente de alimento podría tener un impacto directo en los resultados reproductivos. La relación entre la dieta y la fertilidad en una variedad de organismos también se muestra en estudios previos. Por ejemplo, en el pez cebra, el ácido docosahexaenoico (DHA) mejora la fertilidad, mientras que el ácido araquidónico (ARA) promueve ampliamente la fertilidad en las aves [38]. Además, la dieta también puede influir en procesos biológicos como el metabolismo, la inmunidad y el desarrollo de organismos mediante la transferencia de genes, la regulación de señales y la remodelación de la microbiota intestinal [39,40,41]. Los efectos positivos de los MUFA son particularmente dignos de mención, dada su disponibilidad dietética para utilizar la dieta como herramienta para mejorar los resultados reproductivos tanto en humanos como en otros organismos. De hecho, los efectos proteómicos y de los carbohidratos sobre la fecundidad del NMP también pueden tener un efecto dramático y merecen una mayor investigación.

Los conjuntos de datos presentados en este estudio se pueden encontrar en repositorios en línea. Los nombres del repositorio o repositorios y los números de acceso se pueden encontrar a continuación: Base de datos BioProject del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con el número de acceso PRJNA941926. Todos los demás datos del estudio se incluyen en el artículo y/o en los archivos de información de respaldo.

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Este estudio fue apoyado por el Plan Nacional Clave para la Investigación y el Desarrollo Científico de China (2021YFC2600100 y 2022YFC2602400), la Fundación de Ciencias Naturales de China (NSFC 32230066), los Proyectos Clave de Investigación de la Ciencia Fronteriza de CAS (QYZDB-SSW-SMC014), el Programa de Investigación Científica de Frontera Básica de la Academia de Ciencias de China de 0 a 1 (ZDBS-LY-SM027-03), el Programa de Investigación de Prioridad Estratégica de la Academia de Ciencias de China (Subvención No. XDPB16) y el Programa Nacional de Apoyo al Talento Juvenil de China (Plan Diez Mil Personas).

Estos autores contribuyeron igualmente: Jing Ning, Xiaoting Gu.

Laboratorio Estatal Clave de Manejo Integrado de Plagas de Insectos y Roedores, Instituto de Zoología, Academia China de Ciencias, Beijing, 100101, China

Jing Ning, Xiaoting Gu, Jiao Zhou, Hongxia Zhang, Jianghua Sun y Lilin Zhao

Centro CAS para la Excelencia en Interacciones Bióticas, Universidad de la Academia de Ciencias de China, Beijing, 100049, China

Jing Ning, Xiaoting Gu, Jiao Zhou, Hongxia Zhang y Lilin Zhao

Centro de Ciencias Básicas de Hebei para Interacciones Bióticas/Facultad de Ciencias de la Vida, Institutos de Ciencias de la Vida y Desarrollo Verde, Universidad de Hebei, Baoding, 071002, China

Jianghua Sun

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JN, XG, JS y LZ participaron en el diseño experimental. JN, XG, JZ y HZ fueron responsables del cultivo y muestreo de nematodos y hongos. JN y XG realizaron la detección y cuantificación de lípidos y genes relacionados. JN y XG realizaron pruebas biológicas de ácidos grasos en nematodos y hongos. JN y XG manejaron y representaron gráficamente la mayoría de los datos del manuscrito. JZ y HZ realizaron imágenes microscópicas. JN, XG, JS y LZ escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Lilin Zhao.

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Ning, J., Gu, X., Zhou, J. et al. El ácido palmitoleico como molécula coordinadora entre el nematodo invasor del pino y sus hongos recientemente asociados. ISME J (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01489-8

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Recibido: 07 de marzo de 2023

Revisado: 24 de julio de 2023

Aceptado: 27 de julio de 2023

Publicado: 21 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01489-8

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