El análisis metabolómico revela cambios relacionados con la formación de pseudoquistes inducida por el agotamiento de hierro en Trichomonas vaginalis - Grupo Co., Ltd de ácidos grasos de Chongqing

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 226 (2023) Citar este artículo

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El hierro es un elemento esencial para las funciones celulares, como el metabolismo energético. Trichomonas vaginalis, un patógeno del tracto urogenital humano, es capaz de sobrevivir en el medio ambiente sin suficiente suplemento de hierro. Los pseudoquistes (estructuras similares a quistes) son una etapa ambientalmente tolerada de este parásito aunque se encuentran con condiciones no deseadas, incluida la deficiencia de hierro. Anteriormente demostramos que la deficiencia de hierro induce una glucólisis más activa pero una regulación negativa drástica de las enzimas metabólicas energéticas hidrogenosomales. Por tanto, la dirección metabólica del producto final de la glucólisis sigue siendo controvertida.

En el presente trabajo, realizamos un análisis metabolómico basado en LC‒MS para obtener información precisa sobre los eventos enzimáticos de T. vaginalis en condiciones de agotamiento de hierro (ID).

Primero, mostramos la posible digestión de glucógeno, polimerización de celulosa y acumulación de oligosacáridos de la familia de la rafinosa (RFO). En segundo lugar, un ácido graso de cadena media (AGCM), el ácido cáprico, estaba elevado, mientras que la mayoría de los ácidos grasos C18 detectados se redujeron significativamente. En tercer lugar, los aminoácidos se redujeron en su mayoría, especialmente alanina, glutamato y serina. Treinta y tres dipéptidos mostraron una acumulación significativa en las células ID, lo que probablemente estuvo asociado con la disminución de aminoácidos. Nuestros resultados indicaron que el glucógeno se metabolizó como fuente de carbono y al mismo tiempo se sintetizó el componente estructural celulosa. La disminución de ácidos grasos C18 implicó una posible incorporación en el compartimento membranoso para la formación de pseudoquistes. La disminución de aminoácidos acompañada de un aumento de dipéptidos implicó una proteólisis incompleta. Estas reacciones enzimáticas (alanina deshidrogenasa, glutamato deshidrogenasa y treonina deshidratasa) probablemente estuvieron involucradas en la liberación de amoníaco.

Estos hallazgos resaltaron la posible utilización de glucógeno, biosíntesis de celulosa e incorporación de ácidos grasos en la formación de pseudoquistes, así como la producción de amoníaco precursor de NO inducida por el estrés por falta de hierro.

Trichomonas vaginalis es el agente causante de la enfermedad de transmisión sexual no viral más común, la tricomoniasis. Se cree que se subestima la elevada prevalencia de la tricomoniasis, ya que existen muchas infecciones asintomáticas. Los síntomas de la tricomoniasis varían desde una inflamación leve hasta resultados graves, como parto prematuro y aborto espontáneo [1, 2]. Esta infección suele curarse sola; si es necesario, tinidazol y metronidazol son la primera opción de tratamiento. Sin embargo, la resistencia acumulativa a estos fármacos nos está impulsando a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas [3].

T. vaginalis reside en el tracto urogenital de ambos sexos, donde los nutrientes y elementos esenciales no se suplementan suficientemente. El hierro desempeña funciones biológicas importantes en casi todos los organismos vivos. Informes anteriores indicaron que la supervivencia de las células de tricomonas depende de diferentes estrategias metabólicas en entornos con deficiencia de hierro (ID). Por ejemplo, se cree que la glucólisis más activa supera el defecto de producción de energía en el hidrogenosoma [4, 5]. Todavía es controvertido si la dirección metabólica del producto final de la glucólisis, el piruvato, se ve afectada por estas condiciones, ya que las enzimas posteriores en el hidrogenosoma están casi ausentes en caso de escasez de hierro [4]. El piruvato es un metabolito central que se puede convertir en aminoácidos, lactato y acetil-CoA para una mayor biosíntesis de ATP y ácidos grasos [6]. Investigaciones anteriores indicaron que T. vaginalis carece de un mecanismo completo para digerir o sintetizar ácidos grasos de novo [7]. En consecuencia, se ha prestado menos atención a la regulación de los lípidos y metabolitos relacionados en este protista.

Los quistes son la etapa infecciosa de muchos protozoos patógenos humanos, como Entamoeba histolytica y Giardia intestinalis. El metabolismo en las células formadas por quistes es diferente al del trofozoíto activo. Durante la enquistación de E. histolytica, el metabolismo del glucógeno y los lípidos son más activos para la formación de la pared del quiste y el reordenamiento membranoso, respectivamente [8,9,10,11]. Eventos metabólicos similares también están presentes en G. lamblia, aunque el componente principal de la pared del quiste es β-1,3-GalNac en lugar de quitina en E. histolytica [12].

La deficiencia de hierro y otros desafíos ambientales, como la temperatura fría, inducen la transformación morfológica de T. vaginalis de trofozoíto a pseudoquiste (estructura similar a un quiste) [13, 14]. A diferencia de E. histolytica y G. lamblia, T. vaginalis no sufre un proceso de enquistamiento y carece de pared quística. Sabíamos que el glucógeno se acumulaba y se consumía rápidamente en T. vaginalis durante las fases logarítmicas del cultivo axénico [15]. Se ha demostrado un aumento en el contenido a base de quitina/celulosa en la etapa de pseudoquiste [14]. Sin embargo, aún se desconoce en gran medida la utilización de glucógeno o la biosíntesis de quitina/celulosa regulada por la escasez de hierro en T. vaginalis.

T. vaginalis utiliza sacáridos simples y complejos para su proliferación. Trussell y Johnson demostraron que el protista no utiliza celobiosa, sacarosa o rafinosa como fuente de energía [16]. Sin embargo, un informe reciente sugirió que las células de tricomonas codifican una β-fructosidasa que es capaz de degradar sacarosa y rafinosa [17]. Los oligosacáridos de la familia de la rafinosa (RFO) se encuentran principalmente en plantas y se generan como azúcares de almacenamiento/transporte. Además, las RFO también participan en distintos procesos celulares, como la actividad antioxidante y la transducción de señales [18]. No obstante, no se ha abordado el papel de las ORP en T. vaginalis.

En este estudio, nuestro objetivo fue ilustrar los cambios en la composición de los metabolitos de T. vaginalis inducidos por la escasez de hierro. Mediante el uso de análisis metabolómicos basados en LC-MS, se resaltaron las direcciones metabólicas centradas en el piruvato y también se discutieron los compuestos asociados a pseudoquistes. Encontramos posible degradación de glucógeno, biosíntesis de celulosa y acumulación de RFO en células ID. La mayoría de los ácidos grasos fueron comparables en los controles ID y ricos en hierro (IR), con la expectativa de una elevación significativa del ácido cáprico. Los ácidos grasos C18 estaban mayoritariamente disminuidos, lo que implicaba su incorporación a estructuras membranosas durante la formación de pseudoquistes. Los aminoácidos estaban casi reducidos, especialmente alanina, glutamato y serina, lo que podría explicarse por la acumulación de dipéptidos. Las reacciones enzimáticas en dirección opuesta a la alanina, el glutamato y la serina estuvieron acompañadas de la liberación de amoníaco, que podría ser un sustrato crucial para la producción de óxido nítrico (NO). En conjunto, este análisis metabolómico no dirigido mostró que los sacáridos, ácidos grasos y aminoácidos estaban funcionalmente asociados con la formación de pseudoquistes en T. vaginalis inducida por la limitación de hierro. Estos hallazgos proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos únicos durante la infección y proporcionan objetivos potenciales para futuras investigaciones.

Trichomonas vaginalis (ATCC_30236) se cultivó en medio YIS que contenía hierro (citrato férrico de amoníaco, 180 µM) o el quelante de hierro dipiridilo (180 µM) como los grupos rico en hierro (IR) y deficiente en hierro (ID), respectivamente [23] . Las células IR se recolectaron cuando alcanzaron una densidad de ~ 2 × 106 / ml, mientras que las células ID se recolectaron 6 h después del tratamiento con dipiridilo (DIP, quelante de hierro) [5].

Para cada muestra, se agregaron 1000 µl de solución de extracto (acetonitrilo:metanol:agua = 2:2:1) que contenía un estándar interno (L-2-clorofenilalanina, 2 µg/ml). Después de 30 s de agitación, las muestras se homogeneizaron a 30 Hz durante 4 min y se sonicaron durante 5 min en un baño de agua con hielo. El ciclo de homogeneización y sonicación se repitió dos veces. Luego, las muestras se incubaron a -40 °C durante 1 h y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 15 min a 4 °C. Se transfirió un total de 750 µl de sobrenadante a un tubo nuevo y se secó en un concentrador de vacío a 37 °C. Luego, las muestras secas se reconstituyeron en 200 μl de acetonitrilo al 50% mediante sonicación en hielo durante 10 min. Luego, la constitución se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C y se transfirieron 75 µl de sobrenadante a un vial de vidrio LC-MS nuevo de 2 ml.

La separación por UHPLC se llevó a cabo utilizando un sistema UHPLC serie 1290 Infinity (Agilent Technologies) equipado con una columna UPLC BEH Amide (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters). La fase móvil estaba compuesta por 25 mmol/l de acetato de amonio y 25 de hidróxido de amoníaco en agua (pH = 9,75) (A) y acetonitrilo (B). El análisis se llevó a cabo con un gradiente de elución de la siguiente manera: 0–0,5 min, 95% B; 0,5 a 7,0 min, 95 a 65 % B; 7,0 a 8,0 min, 65 a 40 % B; 8,0 a 9,0 min, 40 % B; 9,0 a 9,1 min, 40 a 95 % B; 9,1–12,0 min, 95 % B. La temperatura de la columna fue de 25 °C. La temperatura del muestreador automático fue de 4 ° C y el volumen de inyección fue de 1 μl (pos) o 1 μl (neg).

Se utilizó espectrometría de masas TripleTOF 6600 (AB Sciex) para adquirir espectros de MS/MS de forma dependiente de la información (IDA) durante un experimento LC-MS. En este modo, el software de adquisición (Analyst TF 1.7, AB Sciex) evaluó continuamente los datos de MS del estudio de escaneo completo mientras recopilaba y activaba la adquisición de espectros MS/MS dependiendo de los criterios preseleccionados. En cada ciclo, los 12 iones precursores más intensivos con intensidades. Se eligieron 100 para MS/MS con una energía de colisión (CE) de 30 eV. El tiempo del ciclo fue de 0,56 s. Las condiciones de la fuente ESI se establecieron de la siguiente manera: gas 1, 60 psi; gas 2, 60 psi; gas de cortina, 35 psi; temperatura de la fuente, 600 °C; potencial de desagrupación, 60 V; voltaje de pulverización de iones flotante (ISVF), 5000 V y − 4000 V en modo positivo o negativo, respectivamente [19].

ProteoWizard convirtió los archivos de datos sin procesar de MS (.wiff) generados en los pasos anteriores al formato mzXML y los procesó el paquete R XCMS (versión 3.2). El proceso incluyó máxima deconvolución, alineación e integración. Minfrac y corte se establecieron en 0,5 y 0,6, respectivamente. Se aplicó una base de datos interna MS2 para la identificación de metabolitos [20].

Las reproductividades de dos conjuntos de metabolómica se analizaron mediante análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA). Se realizaron la prueba t de Student y la importancia de la variable en la proyección (VIP) para resaltar cambios significativos en los metabolitos. Se utilizaron asteriscos para representar la importancia de cada ensayo determinado a través del valor de P (*P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001).

Se recogieron cuatro muestras iguales de células de tricomonas IR e ID para análisis HPLC-QTOF MS. Generalmente, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para mostrar la correlación del conjunto de datos de metabolómica entre los grupos experimentales. Sin embargo, debido al pequeño tamaño de la muestra y las múltiples dimensiones de los metabolitos detectados, el PCA no fue adecuado para nuestro experimento (datos no mostrados). OPLS-DA es otro método para medir las similitudes y diferencias entre entornos experimentales (IR e ID). El gráfico de puntuación de OPLS-DA reveló una correlación dentro de los conjuntos de datos de IR e ID en modos de iones positivos y negativos (Fig. 1a, b). Además, se realizaron pruebas de permutación (n = 999) para cada modo iónico para confirmar aún más la validez de los dos grupos experimentales (Fig. 1c, d). Los valores de R2Y y Q2 fueron> 0,5, lo que sugiere que estas tendencias de agrupamiento de los componentes principales derivados de las muestras se separaron como era de esperar en los modos de iones positivos y negativos.

Análisis multivariado de los datos de UHPLC-MS de grupos ricos en hierro (rojo) y deficientes en hierro (azul). Gráficos de puntuación OPLS-DA (a, b) y análisis de permutación (c, d) (prueba de permutación n = 999) de modos de iones positivos y negativos

Un total de 3277 picos estuvieron presentes en los modos de iones positivos y negativos (1802 y 1475, respectivamente) (Tabla 1). Entre ellos, se anotaron 824 metabolitos después del análisis MS/MS (~ 25 % del total de compuestos). La tasa de anotación del análisis de la metabolómica humana es aproximadamente del 10% [21, 22], lo que sugiere que nuestra tasa de anotación era razonable y adecuada para investigaciones adicionales. Los compuestos anotados se enumeran en el archivo adicional 1.

Hubo 667 compuestos derivados de modos de iones positivos y negativos que exhibieron cambios significativos entre los grupos IR e ID según los gráficos del volcán y los valores VIP (Fig. 2). Los puntos azules representan los compuestos regulados positivamente, mientras que los puntos rojos indican los compuestos regulados negativamente en las células IR en comparación con las células ID. El tamaño de los puntos indica las puntuaciones VIP.

Gráficos de volcanes de compuestos significativamente modificados en modelos de iones positivos (a) y negativos (b). Los puntos rojos representan compuestos regulados positivamente significativamente en las células IR. Los puntos azules representan compuestos regulados negativamente significativamente en las células IR. Los valores de puntuación VIP se indican mediante el tamaño de los puntos. IR, rico en hierro; ID, deficiencia de hierro

Nuestro informe anterior sugirió que la glucólisis es muy activa en ID T. vaginalis [23]. Sin embargo, el piruvato no se convertiría en acetil-CoA para la producción de ATP y ácidos grasos debido a la regulación negativa global de genes/proteínas dentro de los hidrogenosomas en condiciones de ID [4, 5]. Para comprender mejor el destino del piruvato tras el agotamiento del hierro, en este estudio nos concentramos en los compuestos relacionados con el piruvato.

El primer grupo de compuestos en el que nos centramos fueron los oligosacáridos, ya que estaban alterados significativamente en las células ID. La Figura 3 destaca los oligosacáridos más acumulados en las células ID en comparación con el control IR.

Metabolismo de oligosacáridos en Trichomonas vaginalis cultivadas en diferentes concentraciones de hierro. Los niveles de oligosacáridos detectados en este análisis se muestran en gráficos de barras. Los compuestos significativamente regulados se muestran en rojo (P <0,05). Las enzimas correspondientes se enumeran mediante las flechas y se indican los niveles relativos de expresión de ARN (ID/IR). Los genes regulados positivamente en las células ID se muestran en rojo, mientras que los genes regulados negativamente en las células ID se muestran en verde [5]. Los compuestos grises representaron no ser detectables en este análisis. Falta galactinol sintasa en T. vaginalis

La parte izquierda de la Fig. 3 muestra que la isomaltosa, la maltotriosa y la maltopentaosa aumentaron significativamente, excepto la maltosa. Estos di-, tri- y pentasacáridos se generaron a partir de la polimerización de la glucosa o de la degradación del glucógeno. Las expresiones de enzimas relacionadas con estas reacciones, isomaltasa y ɑ-glucosidasas, aumentaron en las células ID (Fig. 3). La expresión de una glucógeno fosforilasa (TVAG_348330) se reguló ligeramente al alza, mientras que la glucógeno sintasa se reguló a la baja en condiciones de limitación de hierro (Fig. 3). De acuerdo con los perfiles de expresión de las enzimas metabólicas del glucógeno, especulamos que la dirección del metabolismo del glucógeno y los oligosacáridos era hacia la degradación.

El glucógeno es un sacárido de almacenamiento que, según se informa, se acumula y se consume rápidamente en la fase logarítmica de T. vaginalis cultivada axénica. La actividad de la glucógeno fosforilasa mostró la misma tendencia que el nivel de glucógeno en la medición anterior [15]. El consumo de glucógeno junto con una glucólisis más activa durante el proceso de enquistamiento se ha demostrado en E. histolytica y G. lamblia [24,25,26]. En el caso de la escasez de hierro, la transición a pseudoquistes y una glucólisis más activa implicó que T. vaginalis sufriera un evento similar a un enquistamiento similar al de los protozoos intestinales. La posible utilización del glucógeno no es sólo para el metabolismo energético sino que también proporciona un sustrato para la síntesis de la pared del quiste, como la quitina [25]. La verdadera pared del quiste está ausente en el seudoquiste de T. vaginalis; sin embargo, sería una dirección catalítica de la glucosa a la celulosa. Esto se discutirá en la siguiente sección.

Otro disacárido se destacó debido a la drástica elevación de las células ID, la celobiosa, en comparación con el control IR (Fig. 3). La celobiosa es el componente básico de la celulosa, un polímero estructural para plantas y quistes [12]. La enzima responsable de la conversión entre NDP-glucosa y celobiosa, la β-glucosidasa, estaba regulada negativamente en las células ID. Por el contrario, en las células ID se encontró una regulación positiva de la celulasa (TVAG_194310), que convierte la celulosa en celobiosa. En particular, la celulasa cataliza reacciones bidireccionales, que también son responsables de la biosíntesis de celulosa [27]. La evidencia podría implicar que la celulasa participa en la biosíntesis de la celulosa en lugar de en su descomposición en celobiosa.

La interconversión de celobiosa y celulosa polimérica está funcionalmente asociada con la estructura celular. Investigaciones anteriores demostraron que los polisacáridos, incluida la quitina, los lípidos acidorresistentes y la celulosa, son la columna vertebral principal para la formación de la pared del quiste en distintos protozoos enquistados [12]. Los pseudoquistes de T. vaginalis se construyen con una arquitectura basada en quitina/celulosa [14]. Aunque existen cuatro genes de quitinasa codificados por T. vaginalis, ninguno de ellos ha sido evaluado. Según nuestro conjunto de datos de expresión de ARN, todas las quitinasas no se alteraron significativamente entre las condiciones IR e ID [5]. Primero demostramos la presencia de celobiosa, un disacárido con un enlace β-1,4-glucosídico de glucosas, que también es el sustrato para la biosíntesis de celulosa. La acumulación de celobiosa estuvo acompañada de una regulación negativa de la β-glicosidasa y una regulación positiva de la celulasa en las células ID. Además, la celobiosa no se utiliza para la proliferación de células de tricomonas [16]. En conjunto, especulamos que la biosíntesis de celulosa podría estar involucrada en la progresión de las células ID durante la formación de pseudoquistes.

Hemos dicho anteriormente que el almacenamiento de glucógeno y el metabolismo estructural de la celulosa se ven afectados por el agotamiento del hierro. Sorprendentemente, nuestro conjunto de datos mostró que los oligosacáridos de la familia de la rafinosa (RFO), incluidas la sacarosa, la rafinosa y la estaquiosa, también se acumularon significativamente en condiciones de ID (Fig. 3). Los RFO son sacáridos compuestos de fructosa, glucosa y galactosa. En la vía sintética, el galactinol se genera primero a partir de UDP-galactosa y mioinositol mediante la galactinol sintasa. El galactinol y la sacarosa son sustratos para la síntesis de rafinosa catalizada por la ɑ-galactosidasa. Posteriormente, la estaquiosa se genera mediante la combinación de rafinosa y galactinol [28]. Los niveles de mioinositol y galactinol se elevaron dramáticamente en las células ID (Fig. 3, abajo a la derecha). Los niveles de ARN de las enzimas relacionadas con la síntesis de RFO, β-fructosidasa (TVAG_254130) y ɑ-galactosidasa (TVAG_145340) también estaban regulados positivamente en las células ID. Aunque no se detectó UDP-galactosa y la galactinol sintasa estuvo ausente en T. vaginalis, las elevaciones evidentes en galactinol y los RFO posteriores nos llevaron a plantear la hipótesis de que las células de tricomonas producían diferentes formas de azúcares para responder a ambientes desfavorables.

Los RFO están ampliamente distribuidos en el reino vegetal y están especialmente bien estudiados en la soja y los garbanzos [18]. Estos oligosacáridos participan en varias funciones biológicas, como el almacenamiento y transporte de carbono, la tolerancia al estrés ambiental y la manipulación del microbioma intestinal humano [18]. Una investigación previa demostró que la tricomonas β-fructosidasa recombinante es capaz de degradar sacarosa y rafinosa [17]. Sin embargo, como azúcar de almacenamiento, la rafinosa no se utiliza para el crecimiento de T. vaginalis [29]. Estas declaraciones sugirieron que no era probable que la rafinosa, la sacarosa y la estaquiosa se utilizaran para la producción de energía y la proliferación celular.

Los RFO se acumulan en condiciones de agotamiento de hierro y actúan como moléculas que responden al estrés en las plantas [30, 31]. La función de las RFO acumuladas refleja la participación de cambios ambientales en casos de cambios de osmolaridad, temperatura e infecciones [32]. Además, los RFO poseen actividad eliminadora de radicales hidroxilo que sería un importante antioxidante [33]. Sugerimos que las especies reactivas de nitrógeno (RNS) en lugar de las especies reactivas de oxígeno (ROS) se acumularan en las células de tricomonas ID. El desequilibrio de la homeostasis redox en circunstancias de limitación de hierro induce el sistema tiorredoxina-peroxiredoxina en T. vaginalis [5]. En consecuencia, especulamos que el aumento de los RFO también podría ser un antioxidante inducido por la escasez de hierro.

En conjunto, planteamos la hipótesis de que el glucógeno se utilizaba como recurso para una glucólisis más activa; por otro lado, la biosíntesis de celulosa se produjo al mismo tiempo que la formación de pseudoquistes. La acumulación de RFO reveló un posible papel antioxidante o de señalización en respuesta a la escasez de hierro, que debería examinarse en detalle en el futuro.

Estudios anteriores han demostrado que T. vaginalis posee maquinaria defectuosa para sintetizar biomoléculas relacionadas con lípidos, como los ácidos grasos [7]. El borrador del genoma también mostró que el protista no codifica genes completos de biosíntesis o betaoxidación de ácidos grasos [34]. Sin embargo, identificamos diferentes tipos de lípidos en el análisis metabolómico.

La Figura 4 muestra que los niveles de ácidos grasos insaturados fueron en su mayoría comparables, excepto por reducciones significativas en los contenidos de ácido linoleico (C18), ácido gamma-linolénico (C18) y ácido erúcico (C22) en células ID. Además, se mostró una disminución drástica en el contenido de ácido esteárico (C18) en las células ID en la categoría de ácidos grasos saturados. Estos resultados indicaron una mayor utilización o una menor síntesis de múltiples ácidos grasos C18 en células de tricomonas ID.

Niveles de ácidos grasos insaturados (a) y saturados (b) identificados en el análisis metabolómico. Los valores relativos de los ácidos grasos identificados se muestran como el cambio en veces de las células ID (barra abierta) a IR (barra cerrada) (ID/IR). La importancia se indica con asteriscos: *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. IR, rico en hierro; ID, deficiencia de hierro

Las alteraciones en el metabolismo de los lípidos podrían estar involucradas en los cambios morfológicos en protozoos patógenos humanos, como la enquistación. En G. lamblia, se investigó la composición de los ácidos grasos y se encontró que los ácidos esteárico (C18) y oleico (C18) son los ácidos grasos más abundantes en Giardia durante la enquistación [35]. Trichomonas vaginalis experimentó una transformación de trofozoítos móviles a pseudoquistes detenidos en condiciones de limitación de hierro [13]. La composición de los ácidos grasos en las células de tricomonas ID (o pseudoquistes) reveló una disminución global de los ácidos grasos C18 (Fig. 4). La diferencia entre los estudios anteriores y los actuales es el estadio de los protistas: enquistados de G. lamblia y pseudoquistes de T. vaginalis. Además, la composición de lípidos regula el proceso de enquistamiento de E. histolytica [11, 36]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que estos ácidos grasos C18 probablemente se incorporaron a estructuras membranosas durante la progresión del enquistamiento.

Aunque la actividad de transacilación participa en la generación de varios lípidos, estudios previos revelaron que T. vaginalis es incapaz de sintetizar ácidos grasos [37]. Sin embargo, los ácidos grasos de origen medio [principalmente ácidos grasos de cadena media (AGCM)] se incorporan a los fosfoglicéridos y los esfingolípidos [7]. De hecho, los fosfolípidos detectables en nuestros resultados se redujeron significativamente, especialmente los derivados de fosfoetanolamidas (PE) (archivo adicional 2). Los derivados de fosfatidilcolina, colina y serina no cambiaron significativamente en el análisis metabolómico (datos no mostrados). Las reducciones en los ácidos grasos y fosfolípidos detectados probablemente se incorporaron a la estructura membranosa de T. vaginalis. En conjunto, estos resultados implicaron que la escasez de hierro redujo la mayoría de los ácidos grasos C18 detectados mediante la supuesta incorporación de ácidos grasos a los fosfolípidos, lo que podría estar asociado con la formación de pseudoquistes en T. vaginalis.

Debido a la falta de enzimas relacionadas en T. vaginalis, la composición de los ácidos grasos no se había documentado en detalle anteriormente. Un gen anotado como precursor de la 2-nitropropano dioxigenasa (TVAG_479680), también conocido como proteína transportadora de enoil-acil reductasa (ENR), participa en la biosíntesis de ácidos grasos [38]. ENR cataliza el paso final de elongación de ácidos grasos de la síntesis de ácidos grasos tipo II (FAS II). La expresión de TvENR mostró una elevación significativa en condiciones de identificación [5]. Aquí, demostramos que un supuesto ácido cáprico sintetizado dependiente de ENR estaba elevado en condiciones de ID, mientras que la mayoría de ellos eran comparables, excepto el ácido esteárico (discutido anteriormente) (Fig. 4b). Este resultado sugirió que existiría un FAS II funcional en T. vaginalis, y que el ácido graso aguas abajo podría modificarse mediante el agotamiento del hierro.

El acetil-CoA es el componente esencial de los ácidos grasos, que se pensaba que estaba reducido en las células ID ya que la enzima piruvato:ferredoxina oxidorreductasas (PFO) disminuyó drásticamente en las células ID [5, 34]. Sugerimos que la acumulación de ácido cáprico podría utilizar acetil-CoA que no se origina ni en la glucosa ni en los sustratos conocidos restantes o que se genera a partir de la degradación de ácidos grasos más largos, como el ácido esteárico (C18) [37]. Sin embargo, aún no se puede descartar si el transporte de ácidos grasos desde el medio de cultivo fue inducido por la limitación de hierro.

Los lípidos son una fuente importante de energía, especialmente con una suplementación limitada de azúcar. Investigaciones anteriores revelaron que las actividades enzimáticas asociadas con la β-oxidación están ausentes en T. vaginalis [37]. Aquí, demostramos que al menos tres ácidos grasos insaturados se redujeron significativamente en las células ID (Fig. 4). La expresión de ARNm de la acil-CoA sintetasa de ácidos grasos de cadena larga, el primer paso enzimático en la oxidación de ácidos grasos, aumentó ligeramente, lo que implica además el uso de ácidos grasos por parte de T. vaginalis [5]. Sin embargo, esta hipótesis debería verificarse en el futuro.

El único ácido graso acumulado identificado en este estudio es el ácido cáprico (conocido como ácido decanoico), un MCFA. Los AGCM (compuestos por entre 7 y 12 carbonos) tienen importantes funciones biológicas en las células [39]. Informes anteriores demostraron que los AGCM son moléculas cruciales para el almacenamiento de energía. La cadena de carbono relativamente corta es una ventaja para el transporte a las mitocondrias y, por lo tanto, es más fácil de catalizar [40]. Además, se generan menos ROS durante la β-oxidación de los AGCM en comparación con los ácidos grasos de cadena larga [41]. Además de la producción de energía, se han revelado funciones reguladoras de los AGCM, como la mejora de la glucólisis en el cerebro [42]. Este fenómeno refleja el hecho de que la glucólisis es más activa en T. vaginalis tras el agotamiento del hierro [23]. Los AGCM también mejoran la gluconeogénesis. Sin embargo, las enzimas clave están ausentes en T. vaginalis [34, 43]. Por lo tanto, la acumulación de ácido cáprico podría estar relacionada con la regulación metabólica de T. vaginalis en caso de escasez de hierro.

En conjunto, nuestros resultados sugirieron que la utilización de ácidos grasos C18 fue en respuesta a la transformación de pseudoquistes. El metabolismo energético, como la glucólisis y la catálisis de ácidos grasos, se vio alterado por el agotamiento del hierro, que posiblemente estuvo regulado por la acumulación significativa de ácido cáprico.

El catabolismo de muchos aminoácidos depende de la presencia de piruvato. Demostramos una proteólisis más activa a través del sistema de ubiquitina-proteosoma (UPS) desencadenada por la escasez de hierro [5]. Además, varias enzimas proteolíticas estaban reguladas positivamente en las células ID. La proteólisis es responsable de la eliminación y el reciclaje de aminoácidos. En consecuencia, asumimos que los aminoácidos se acumularían en las células de tricomonas en condiciones de limitación de hierro. Sin embargo, el conjunto de datos mostró una disminución en los niveles de aminoácidos en las células ID.

Entre los aminoácidos detectados, solo la alanina, el glutamato y la serina se redujeron significativamente en las células ID (Fig. 5a). La alanina deshidrogenasa y la treonina deshidratasa catalizan la conversión de alanina y serina en piruvato, respectivamente. Además, la glutamato deshidrogenasa es responsable de la conversión entre glutamato y ɑ-cetoglutarato (Fig. 5b-d). Es de destacar que todas estas reacciones fueron acompañadas de la liberación de amoníaco. Otros catabolismos de aminoácidos asociados con la liberación de amoníaco, incluidos arginina, asparagina, cisteína, glutamina, metionina, treonina y triptófano, se redujeron en comparación con el control IR, aunque sin significación (Fig. 5a). Por lo tanto, estos aminoácidos se redujeron con una tendencia de regulación positiva similar a la de las enzimas correspondientes en las células ID, lo que implica que estas reacciones catalizaron en la dirección opuesta a la que generó amoníaco.

Composición de aminoácidos en T. vaginalis cultivadas en diferentes concentraciones de hierro. Los aminoácidos detectados en IR (barras cerradas) e ID (barras abiertas) se muestran (a). La importancia se indica con asteriscos: *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. b – d Se muestran las reacciones de alanina deshidrogenasa, glutamato deshidrogenasa y treonina deshidratasa. Los niveles relativos de expresión de ARN (ID/IR) de los genes se indican en colores rojo (regulado al alza en ID) y verde (regulado a la baja en ID) [5]. IR, rico en hierro; ID, deficiencia de hierro

El glutamato es el centro metabólico de varios aminoácidos [34]. La leucina y la lisina mostraron niveles sin cambios o ligeramente elevados en las células ID. La enzima cataliza la conversión de glutamato en isoleucina, leucina y valina, aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) aminotransferasas (TVAG_026740), que están reguladas positivamente en condiciones de ID, mientras que la lisina aminotransferasa es indetectable a nivel de ARN [5]. El ligero aumento de leucina y lisina implicó que las direcciones catalíticas del glutamato no eran solo hacia el ɑ-cetoglutarato sino también hacia la leucina y la lisina (Fig. 5a).

El óxido nítrico (NO) desempeña un papel crucial en la supervivencia de las células de tricomonas ID; sin embargo, la generación de NO dependiente de arginina ocupó sólo ~ 20% del NO total, lo que indica que la mayor parte del NO se sintetizó mediante diferentes mecanismos desconocidos [5]. El amoníaco es un compuesto que contiene nitrógeno que se puede convertir en NO mediante oxidación [44, 45]. El metabolismo del amoníaco tiene lugar en el hidrogenosoma de T. vaginalis mediante la actividad de la hidroxilamina reductasa (HCP, TVAG_336320), que se expresa altamente en las células ID [46]. Además, se sabe que el HCP elimina el NO en el modelo bacteriano, lo que indica un posible vínculo entre el amoníaco y el metabolismo del NO en T. vaginalis [47]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el amoníaco derivado del catabolismo de los aminoácidos podría ser un sustrato importante para la producción de NO en T. vaginalis en condiciones de agotamiento de hierro.

La mayoría de los aminoácidos reducidos en las células ID se han comentado anteriormente; sin embargo, no está claro si participan otros mecanismos además del catabolismo de aminoácidos. Una fracción de dipéptidos ocupó los compuestos anotados del conjunto de datos y atrajo nuestra atención. Los dipéptidos están compuestos de dos aminoácidos unidos con enlaces peptídicos y se generan de forma proteolítica o proteinogénica [48, 49]. Teóricamente, existen 400 combinaciones posibles de dipéptidos. En la presente investigación, identificamos 170 dipéptidos (Fig. 6). Entre ellos, 33 se acumularon en células ID, mientras que 9 estaban elevados en células IR. Este resultado podría ser una explicación, en parte, de que la reducción general del nivel de aminoácidos en las células ID sea causada por la acumulación de dipéptidos. Los dipéptidos con prolina N-terminal, valina y fenilalanina fueron los más abundantes en las células ID. De hecho, las expresiones de dipeptidasas y dipeptidil peptidasas estaban en su mayoría reguladas positivamente en células ID; por lo tanto, no se pudo determinar el mecanismo sintético de los dipéptidos [5].

Alternaciones en las cantidades de dipéptidos en T. vaginalis cultivadas en diferentes concentraciones de hierro. Los niveles relativos de dipéptidos identificados se enumeran en este cuadro. En este trabajo se identificaron un total de 170 dipéptidos. Los dipéptidos sin diferencias significativas están etiquetados con ◎. Los dipéptidos acumulados en las células IR están marcados con un cuadrado negro, mientras que los dipéptidos acumulados en las células ID están marcados con un círculo negro (P <0,05)

Los dipéptidos compuestos de residuos de cisteína están relacionados con la actividad antioxidante [50]. Sin embargo, como desequilibrio redox causado por el agotamiento de hierro, los únicos dipéptidos identificados que contienen cisteína, Ile-Cys y Lys-Cys, no fueron modificados por el contenido de hierro en T. vaginalis. Los dipéptidos también desempeñan funciones reguladoras. La enzima glicolítica gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es el objetivo del dipéptido Tyr-Asp. La interacción entre GAPDH y Tyr-Asp da como resultado la restricción de la actividad enzimática [51]. Esto sugirió que estos dipéptidos acumulados específicos del estrés podrían participar en la regulación biológica en T. vaginalis.

En resumen, la reducción general de los niveles de aminoácidos en las células ID podría estar asociada con la acumulación de dipéptidos. Además, la reducción significativa de alanina, glutamato y serina estuvo acompañada por la liberación de amoníaco, que probablemente fue el sustrato para la producción de NO en el protista en ambientes deficientes en hierro.

En este estudio, realizamos un análisis metabolómico no dirigido para ilustrar las direcciones metabólicas de la glucosa y el piruvato. Descubrimos que la posible degradación del glucógeno, la polimerización de la celulosa y la síntesis de RFO ocurrieron al mismo tiempo para una glucólisis, formación de pseudoquistes y antioxidación más activas, respectivamente. El ácido cáprico fue el único ácido graso que se acumuló en las células de tricomonas ID, mientras que la mayoría de los ácidos grasos C18 se redujeron significativamente. Esto podría deberse a alteraciones de la estructura membranosa durante la formación del pseudoquiste. Por último, la reducción general del nivel de aminoácidos probablemente fue causada por la acumulación de dipéptidos. La liberación de amoníaco a partir de reacciones de catabolismo de alanina, glutamato y serina fue el posible sustrato para la producción de NO en T. vaginalis tras la deficiencia de hierro. Estos hallazgos proporcionan información sobre los cambios metabólicos principalmente hacia la formación de pseudoquistes inducidos por el agotamiento de hierro. En la Fig. 7 se muestra un modelo propuesto.

El modelo propuesto de cambios metabólicos en T. vaginalis en ambientes limitados en hierro. Una vez que las células de tricomonas encontraron condiciones de deficiencia de hierro, la mayoría de las células se transformaron en pseudoquistes. La fuente de carbono de la glucólisis más activa se deriva de la hidrólisis del glucógeno debido a la acumulación de oligosacáridos compuestos de glucosa con enlaces ɑ-1,4. La acumulación de celobiosa fue un posible indicio de la biosíntesis de celulosa, que es el componente conformacional crucial de los pseudoquistes. La reducción de los ácidos grasos C18 implicó la incorporación a fosfolípidos para la formación de pseudoquistes. La acumulación de ácido cáprico podría estar implicada en la regulación de la glucólisis o como molécula de señalización en respuesta a entornos limitados en hierro. La reducción de aminoácidos probablemente se debió a la acumulación de dipéptidos o a una proteólisis incompleta. Además, las reducciones significativas de alanina, glutamato y serina estuvieron involucradas en la liberación de amoníaco, que probablemente fue un recurso clave para la síntesis de óxido nítrico en T. vaginalis. Los compuestos etiquetados en colores rojo y verde representan acumulación y reducción en las células ID, respectivamente. Los metabolitos de color gris fueron los metabolitos especulados asociados con los compuestos detectados. La supuesta función molecular o vías estaban etiquetadas en color azul.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos adicionales 1 y 2).

Deficiencia de hierro

Rico en hierro

Oligosacáridos de la familia de la rafinosa

Ácido graso de cadena media

Óxido nítrico

Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales

Importancia variable en la proyección

Análisis de componentes principales

Cromatografía líquida de alta resolución-tiempo de vuelo cuadrupolo

Especies reactivas de nitrógeno

Especies de oxígeno reactivas

Fosfoetanolamidas

Proteína reductasa transportadora de enoil-acil

Síntesis de ácidos grasos tipo II

Piruvato:ferredoxina oxidorreductasa

Sistema ubiquitina-proteasoma

Aminoácido de cadena ramificada

Hidroxilamina reductasa

Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

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Agradecemos a BioTools (Taiwán) por su ayuda en el análisis metabolómico en este estudio.

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán (NSTC 111-2320-B-006-068 para WHC y NSTC 110-2320-B-182-016-MY3 para PT) y la financiación de la investigación del Chang Gung Memorial Hospital ( CMRPD1K0471/CMRPD1K0472 a PT).

Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Cheng Kung, Tainan, Taiwán

Wei Hung Cheng

Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Cheng Kung, Tainan, Taiwán

Wei Hung Cheng

Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Distrito Guishan, Ciudad de Taoyuan, Taiwán

Po-Jung Huang

Laboratorio central de medicina genómica, Hospital Conmemorativo Chang Gung, Linkou, Taiwán

Po-Jung Huang, Chi-Ching Lee y Yuan-Ming Yeh

Departamento de Ciencias de la Computación e Ingeniería de la Información, Facultad de Ingeniería, Universidad Chang Gung, Distrito de Guishan, Ciudad de Taoyuan, Taiwán

Chi Ching Lee

Instituto de Graduados en Tecnología de la Industria de la Salud, Universidad de Ciencia y Tecnología Chang Gung, Taoyuan, Taiwán

Yuan Ming Yeh

Instituto de Graduados en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Taoyuan, Taiwán

Yuan Ming Yeh

Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad Chang Gung, Distrito Guishan, Ciudad de Taoyuan, Taiwán

Seow-Chin Ong, Rose Lin, Fu-Man Ku y Petrus Tang

Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas Moleculares, Hospital Conmemorativo Chang Gung, Linkou, Taiwán

Cheng-Hsun Chiu y Peter Tang

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WHC diseñó los experimentos; CCL, PJH e YMY realizaron el trabajo de bioinformática; WHC, RL y FMK realizaron los experimentos; WHC escribió el manuscrito; MLC, CHC y PT revisaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Petrus Tang.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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: La lista de compuestos anotados identificados en el análisis metabolómico.

: La cantidad relativa de derivados de fosfolípidos identificados en el análisis metabolómico. Los valores relativos de los derivados de fosfolípidos identificados se muestran como el cambio de células ID (barra gris) a IR (barra negra) (ID/IR). La importancia se indica con asteriscos: *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. IR, rico en hierro; ID, deficiencia de hierro.

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Cheng, WH., Huang, PJ., Lee, CC. et al. El análisis metabolómico revela cambios relacionados con la formación de pseudoquistes inducida por el agotamiento de hierro en Trichomonas vaginalis. Vectores de parásitos 16, 226 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05842-w

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Recibido: 13 de marzo de 2023

Aceptado: 18 de junio de 2023

Publicado: 06 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05842-w

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