acilo potente

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1455 (2023) Citar este artículo

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Identificar cómo actúan las moléculas pequeñas para matar los parásitos de la malaria puede conducir a nuevos objetivos "validados químicamente". Al presionar los parásitos en etapa sanguínea asexual de Plasmodium falciparum con tres nuevos compuestos antipalúdicos estructuralmente no relacionados (MMV665924, MMV019719 y MMV897615) y realizar un análisis de secuencia del genoma completo en líneas de parásitos resistentes, identificamos múltiples mutaciones en la acil-CoA sintetasa de P. falciparum ( ACS) genes PfACS10 (PF3D7_0525100, M300I, A268D/V, F427L) y PfACS11 (PF3D7_1238800, F387V, D648Y y E668K). El reemplazo alélico y el perfil de proteoma térmico validan a PfACS10 como objetivo de estos compuestos. Demostramos que esta proteína es esencial para el crecimiento del parásito mediante eliminación condicional y observamos una mayor susceptibilidad al compuesto al reducir la expresión. La inhibición de PfACS10 conduce a una reducción de los triacilgliceroles y a una acumulación de sus precursores lipídicos, lo que proporciona información clave sobre su función. El análisis del gen PfACS11 y sus mutaciones apunta a un papel en la mediación de la resistencia a través de la disminución de la estabilidad de las proteínas.

A pesar de los notables avances hacia la eliminación de la malaria, el Informe Mundial sobre la Malaria de 2022 estimó 247 millones de nuevos casos y 619.000 muertes atribuibles a la malaria en 20211. Se utiliza un número limitado de clases de medicamentos antipalúdicos para tratar la enfermedad, y existe un grado de resistencia a casi todos los agentes terapéuticos. ha ocurrido en al menos algunas poblaciones del parásito Plasmodium falciparum en áreas endémicas. La identificación de nuevos antipalúdicos que se dirijan a vías novedosas es esencial para aumentar el repertorio de fármacos disponibles.

Durante la última década, se han analizado más de 5 millones de compuestos contra P. falciparum en análisis fenotípicos y se han identificado más de 25 000 resultados con actividad baja o submicromolar2,3,4,5,6,7. La identificación de objetivos químicamente validados de estos compuestos exitosos puede catalizar el uso de enfoques poderosos, como el descubrimiento de fármacos guiado por estructuras, la detección de fragmentos o bibliotecas codificadas por ADN, para acelerar el descubrimiento y desarrollo de fármacos contra la malaria. El consorcio Malaria Drug Accelerator (MalDA) busca identificar nuevos objetivos farmacológicos en P. falciparum mediante un enfoque quimiogenómico8, centrándose en pequeñas moléculas identificadas como aciertos en la detección fenotípica de células completas. Una estrategia importante de este consorcio es aplicar la evolución in vitro de parásitos resistentes y la secuenciación de próxima generación de alto rendimiento, que ha identificado múltiples objetivos y mecanismos de resistencia novedosos9,10,11,12.

Aquí aprovechamos informes anteriores de experimentos de evolución de resistencia in vitro con tres estructuras químicas distintas (MMV665924, MMV019719 y MMV897615) para obtener nuevos conocimientos sobre los objetivos farmacológicos candidatos PfACS10 y PfACS11, miembros conservados de la acil-CoA sintetasa de P. falciparum (PfACS). familia de enzimas8,12,13. Las enzimas PfACS son más similares a las sintetasas de ácidos grasos de cadena larga (ACSL), que activan los ácidos grasos libres (FA) de una cadena de acilo preferida de 12 a 20 al acoplarlos a la coenzima A en un proceso de dos pasos dependiente de ATP. , dando como resultado acil-CoA14. Los ACSL eucariotas muestran preferencias por longitudes de sustrato de FA y grados de saturación específicos15,16,17,18. Los parásitos eliminan los AG del huésped19,20 y la activación de los AG por los PfACS les permite incorporarse a diversas especies de lípidos esenciales para el crecimiento del parásito. Esto incluye la acumulación de lípidos neutros (triacilgliceroles y diacilgliceroles) en gotitas de lípidos21,22.

Utilizando reemplazo alélico y perfiles de proteoma térmico, en este documento proporcionamos evidencia de que PfACS10 es una proteína esencial y el objetivo de MMV665924, MMV019719 y MMV897615. La inhibición de PfACS10 conduce a una reducción de los triacilgliceroles y a una acumulación de sus precursores lipídicos. Por otro lado, si bien el reemplazo alélico de mutaciones en PfACS11 fenocopia las líneas seleccionadas, nuestros datos de eliminación condicional demuestran que PfACS11 no es esencial para el crecimiento del parásito asexual, lo que implica que PfACS11 puede estar mediando la resistencia en lugar de ser un objetivo directo.

Trabajos anteriores del consorcio MalDA identificaron MMV019719 y MMV665924 como dos nuevos éxitos fenotípicos de Medicines for Malaria Venture (MMV) Malaria Box8,12, químicamente diversos. Las selecciones de resistencia con MMV665924 dieron como resultado mutaciones en dos nuevos objetivos putativos en la familia de enzimas acil-CoA sintetasa (PfACS) de P. falciparum: PfACS10 (PF3D7_0525100, M300I) y PfACS11 (PF3D7_1238800, D648Y y E668K). Las selecciones con MMV019719 dieron como resultado una única mutación en PfACS11 (F387V). Para verificar el papel de estas mutaciones a la hora de conferir resistencia a estos dos compuestos (la resistencia se define aquí como un cambio de más del doble en los valores de EC50 en cultivo in vitro en comparación con la línea parental), utilizamos la tecnología CRISPR/Cas9 para realizar pruebas alélicas. reemplazos de un subconjunto de las mutaciones observadas (Figura 1 complementaria y Tabla 1 complementaria). Utilizando la línea parental 3D7, introdujimos las mutaciones puntuales individuales F387V o E668K en PfACS11 y M300I en PfACS10, produciendo las líneas editadas genéticamente ACS11F387V_C, ACS11E668K_C y ACS10M300I_C. Estos parásitos fenocopiaron el aumento en los valores de CE50 observados en los fármacos seleccionados en comparación con los parásitos de tipo salvaje (Fig. 1a-c y Datos complementarios 1). Estos hallazgos confirman que las mutaciones en PfACS10 y PfACS11 identificadas mediante selecciones de resistencia con MMV019719 y MMV665924 son suficientes para reducir la susceptibilidad a estos compuestos. La detección de resistencia cruzada de líneas de parásitos seleccionadas y editadas con CRISPR reveló que tanto E668K como F387V en PfACS11 confirieron una reducción similar en la susceptibilidad a las líneas de parásitos seleccionadas con MMV019719 y MMV665924 (Datos complementarios 1). En comparación con la línea parental, los parásitos ACS10M300I también mostraron un aumento de 2,5 veces en la CE50 para MMV019719 (Datos complementarios 1). No detectamos ningún cambio en la CE50 frente a otros antipalúdicos (atovacuona, amodiaquina, mefloquina o quinina) ni en las líneas seleccionadas ni en las editadas genéticamente en comparación con el padre 3D7 (ANOVA unidireccional seguido de la prueba posterior de Dunnett, Datos complementarios 2 ). Estos resultados indican que PfACS10 M300I y PfACS11 E668K y F387V son suficientes para conferir resistencia a dos compuestos de estructuras químicas distintas.

a Estructuras químicas de los compuestos utilizados en la selección de fármacos. b-d Curvas de respuesta a la dosis para un ejemplo representativo de la línea parental 3D7 (negra), las líneas seleccionadas (ACS11E668K_S, ACS11F387V_S y ACS10M300I_S) y las líneas editadas genéticamente (ACS11E668K_C, ACS11F387V_C y ACS10M300I_C) frente al compuesto utilizado para seleccionar las líneas resistentes. Se ejecutaron al menos tres réplicas biológicas para cada cepa por triplicado técnico. Se muestran el ±SD promedio y la curva de regresión no lineal ajustada para un ensayo biológico realizado por triplicado. Los significados estadísticos para EC50 se informan en los Datos complementarios 1 y los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Más recientemente, realizamos selecciones en una línea hipermutadora de P. falciparum (Dd2-Polδ23) con MMV897615, que produjo tres nuevas mutaciones en PfACS10 que confieren al menos un aumento de siete veces en la resistencia (ACS10A268D, ACS10A268V y ACS10F427L, Fig. 2). y Datos complementarios 1 y 3). MMV897615 (19f) es parte de una serie de derivados de quinazolinona-2-carboxamida desarrollados para tener una actividad nanomolar baja y de acción rápida contra parásitos en etapa sanguínea asexual, actividad moderada contra parásitos en etapa hepática y eliminación in vivo de P. falciparum en una forma humanizada. Modelo de ratón SCID24. Probamos si estas líneas mutantes también mostrarían resistencia a MMV665924 y MMV019719 (Fig. 2 y Datos complementarios 1). Los parásitos ACS10F427L_S mostraron niveles de EC50 cinco veces y 20 veces más altos para MMV65924 y MMV019719, respectivamente. Sin embargo, los cambios en la posición 268 tuvieron un fenotipo más matizado. La línea ACS10A268D_S no mostró ningún cambio en la susceptibilidad a MMV665924, pero fue 10 veces más susceptible a MMV019719 en comparación con la línea parental. Por el contrario, la línea ACS10A268V_S fue dos veces más susceptible a MMV665924 pero dos veces más resistente a MMV019719 en comparación con la línea parental. Esta sensibilidad diferencial de las mutaciones a diferentes compuestos recuerda a la sensibilidad colateral, por la que la resistencia a un fármaco aumenta la susceptibilidad a otro. En general, nuestros hallazgos sobre la resistencia evolucionada a MMV897615 fortalecen la hipótesis de que PfACS10 es un objetivo principal de estos compuestos.

Los valores medios de EC50 ± SD para cepas que contienen mutaciones en PfACS10 seleccionadas en la línea Dd2-Polδ (A268D, A268V y F427L) y en 3D7 (M300I) se muestran para MMV897615, MMV665924 y MMV019719. Los ensayos se realizaron por triplicado y al menos se repitieron dos veces. ANOVA con pruebas posteriores de Dunnett comparó mutaciones en la línea Dd2-Polδ, ap < 0,001, pb = 0,005. La prueba t de Student bilateral no pareada comparó 3D7 y ACS10M300I_C. cp = 0,0003, dp = 0,0000008, ep = 0,0016. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen y en Datos complementarios 1.

Para comprender si existen variantes preexistentes en los genes PfACS10 y PfACS11 en poblaciones naturales (Datos complementarios 4), comparamos la diversidad y la divergencia entre cohortes de parásitos obtenidas de Malawi y Senegal (Fig. 3a). En ambos casos, PfACS10 estaba en el percentil 95 para la diversidad de nucleótidos por pares (π) dentro de cada país, así como la divergencia (FST) entre Malawi y Senegal.

EC50 a Diversidad de nucleótidos por pares (π) y divergencia (FST) entre poblaciones de Malawi y Senegal para 4614 genes en P. falciparum. Los miembros de la familia ACS están indicados en rojo. El percentil 95 se indica con una línea de puntos. En general, π por pares de Malawi y Senegal está altamente correlacionado (Pearson R2 de dos colas = 0,94, p < 1 × 10−15) y, en general, relativamente bajo (mediana de 0,0003207 y 0,0003214 para Senegal y Malawi, respectivamente). b Distribución del polimorfismo de un solo nucleótido no sinónimo con MAF global > 0,01 de aislados globalmente diversos (www.malariagen.net/pf3k). La longitud de las barras representa el MAF local de cada variante en África occidental (azul) o oriental (púrpura). Las variantes seleccionadas se indican con flechas rojas, azules y amarillas. Los cuadros de color verde oscuro indican los motivos ACS: P: bucle P, G: motivo puerta, A: sitio de unión de adenina, L: enlazador. c Ensayo de dosis-respuesta representativo para una línea clonal de CF04.008 (ACS10 M300, gris) y dos líneas clonales de CF04.009 (ACS10 M300I, rojo) de Malawi. Los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron dos veces. Se muestran el ±SD promedio y la curva de regresión no lineal ajustada para un ensayo biológico realizado por triplicado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Frecuencia de alelo menor MAF, diversidad de nucleótidos por pares π dentro de cada país, divergencia FST.

Entre las variantes naturales comunes (Fig. 3b), encontramos una mutación que también había evolucionado in vitro en parásitos cultivados seleccionados con MMV665924 (ACS10M300I_S). La variante ACS10M300I estuvo presente en el 78% de los aislamientos de Malawi de un área de alta transmisión25. Para probar si la variante M300I en su origen genético natural confiere resistencia a MMV665924, adaptamos al cultivo aislados de dos muestras derivadas de pacientes en Malawi26: una que no contenía mutaciones en PfACS10 (CF04.008) y la otra que albergaba la sustitución M300I (CF04). .009). Los ensayos de crecimiento inhibidor de aislados clonados mostraron una CE50 cinco veces mayor en el aislado M300I (Fig. 3c y Datos complementarios 1), lo que proporciona evidencia de que la variante M300I en su fondo genético natural podría contribuir a reducir la susceptibilidad del parásito a MMV665924.

Para examinar la distribución de variantes naturales (Datos complementarios 4) y mutaciones asociadas a resistencia en las estructuras proteicas de PfACS10 y PfACS11, utilizamos modelos de homología generados por Alphafold27 (https://www.alphafold.ebi.ac.uk). /). Las mutaciones en PfACS10 asociadas con resistencia o sensibilidad colateral a MMV019719, MMV665926 y MMV897615 (M300I, A268D/V y F427L) ocurren dentro de un bolsillo interno de los modelos de proteína PfACS (Fig. 4), que en otros organismos aloja el acil- cadena de sustratos FA14,28,29,30. También se encontraron varias variantes naturales en PfACS10 (S273A, A402G, A266S) cerca de las mutaciones asociadas a la resistencia en el bolsillo de unión de FA.

un modelo AlphaFold de la estructura de PfACS10. b Las mutaciones que confieren resistencia a MMV665924 y MMV897615 ocurren dentro de la bolsa de unión de ácidos grasos de PfACS10. La posición de las mutaciones que confieren resistencia M300I, F427L y A268D/V se representan en rojo. Varias variantes genéticas no sinónimas en la base de datos MalariaGen Pf3k con alta frecuencia de alelos menores también ocurren dentro de la bolsa de unión de ácidos grasos (A402G, S273A, A266S). c Modelo AlphaFold de ACS11. d La mutación F387V (representada en rojo) se localiza en el bolsillo de unión de ácidos grasos previsto de la proteína PfACS11. Las posiciones de aminoácidos con variantes genéticas no sinónimas en la base de datos MalariaGen Pf3k (www.malariagen.net/pf3k) con frecuencia de alelos menores> 0,01 se representan en naranja (Fig. 3 y Suplemento 4). Las mutaciones asociadas a la resistencia se representan en rojo.

En PfACS11, solo la mutación F387V recubre el bolsillo de unión de FA. Las mutaciones D648Y y E668K ocurren en pliegues adyacentes que miran a la región de unión a nucleótidos del dominio C-terminal de PfACS11. En esta región también se producen mutaciones PfACS11 previamente informadas (E660K y K462N), que confieren resistencia a los bioisósteros de pantotenamida31,32. Estas observaciones sugieren que las mutaciones en la zona de unión de FA pueden conferir resistencia al alterar la unión del inhibidor.

Para explorar si las mutaciones en PfACS10 y PfACS11 podrían realmente alterar las interacciones con los inhibidores que se unen a la bolsa de FA, probamos Triacsin C, un imitador de FA poliinsaturado que inhibe las enzimas ACS de cadena larga en otros organismos, en un subconjunto de parásitos que portan mutaciones individuales en PfACS10 ( M300I) o PfACS11 (F387V, D648Y y E668K). Los parásitos mutantes mostraron una sensibilidad diferencial a este compuesto, con efectos más fuertes resultantes de las mutaciones PfACS10 M300I y PfACS11 F387V que recubren la bolsa de FA. Estos resultados son consistentes con la hipótesis de que estas mutaciones alteran las interacciones dentro del bolsillo de unión al sustrato de FA de las enzimas (Figura complementaria 2 y Datos complementarios 2).

Para investigar más a fondo el papel de PfACS10 en el mecanismo de resistencia, utilizamos el sistema de aptámeros TetR-DOZI para generar parásitos de eliminación condicional de PfACS10 (ACS10cKD). La retirada de anhidrotetraciclina (aTc) da como resultado niveles reducidos de proteína del gen etiquetado con aptámero; sin embargo, no pudimos introducir una etiqueta de proteína en PfACS10 para medir la reducción de proteínas en condiciones inducibles. Sin embargo, se observó que la eliminación de aTc causaba la pérdida de la proliferación del parásito en la línea ACS10cKD (Fig. 5a). Estos resultados confirman la esencialidad de PfACS10 en parásitos en estadio sanguíneo asexual, como se sugirió previamente a partir de un modelo knockout de P. berghei34. La eliminación de PfACS10 resultó en una hipersensibilidad significativa del parásito a MMV019719, MMV665924 y MMV897615 (Fig. 5b-d, prueba t de Student no apareada p <0.01, Datos complementarios 1), consistente con una interacción inhibidora de estos compuestos con PfACS10 directa o indirectamente dentro del mismo vía35.

La línea de eliminación condicional para PfACS10 se generó con el sistema TetR-aptámero, similar a las líneas ACS11cKD y YFPcKD generadas previamente40. La viabilidad de las líneas se probó eliminando la anhidrotetraciclina (aTc) y midiendo la proliferación del parásito mediante la luminiscencia del gen indicador de la luciferasa después de 72 h. a La pérdida de PfACS10 resultó en un bloqueo completo del crecimiento, mientras que e la pérdida de PfACS11 resultó en una reducción del crecimiento del 20%. Se muestra una réplica biológica ejecutada por triplicado. Las pruebas de significancia utilizaron una prueba t de Student no pareada bilateral: a: p = 0,0000005, b: p = 0,012. Ejemplo de curvas de respuesta a la dosis para b, f MMV019719, c, g MMV665924 y d, h MMV897615, probadas en presencia de aTc alta (50 nM) o aTc baja (aTc 5 nM para ACS10cKD para permitir un crecimiento mínimo). o ninguna ATc para ACS11cKD y YFPcKD. Los parásitos ACS10cKD con aTc baja fueron significativamente más susceptibles a todos los compuestos en comparación con los de aTc alta. Se muestran el ±SD promedio y la curva de regresión no lineal ajustada para un ensayo biológico realizado por triplicado. Por el contrario, los parásitos ACS11cKD fueron menos susceptibles a los compuestos en ausencia de aTc, mientras que la concentración de aTc no tuvo ningún efecto sobre la línea YFPcKD. Los significados estadísticos para EC50 se informan en los Datos complementarios 1 y los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Proteína fluorescente amarilla YFP, anhidrotetraciclina aTc.

Para determinar si PfACS10 es un objetivo directo de los compuestos o está involucrado de otro modo en un mecanismo de resistencia, utilizamos el perfilado de proteoma térmico (TPP), que es un método eficaz e imparcial para demostrar la interacción entre el compuesto y el objetivo. Este enfoque se basa en el principio de que la unión de un fármaco a su proteína diana puede alterar significativamente la estabilidad térmica de esa proteína36. Aquí, empleamos una versión de células completas de TPP para identificar los objetivos moleculares de MMV897615, mediante el tratamiento de parásitos cultivados con MMV897615 500 nM o vehículo DMSO durante 1 h antes de la preparación del lisado celular. Establecimos curvas de fusión completa para 2311 proteínas en el rango de temperatura de 37 °C a 72 °C, lo que representa una cobertura >43% del proteoma de P. falciparum. Esto se compara favorablemente con la cobertura informada para TPP anteriores y ensayos de cambio térmico celular junto con estudios de espectrometría de masas (MS-CETSA) con P. falciparum37,38. Los conjuntos de datos del TPP se analizaron utilizando el método estándar basado en la temperatura de fusión (Tm), como se describe en una publicación anterior del TPP39. Este análisis evalúa las curvas de fusión de proteínas individuales utilizando varios criterios, incluida la curva R2, la variabilidad en los valores de Tm dentro de la muestra de control, la meseta máxima de la curva y la pendiente mínima. Luego se establecen las diferencias del punto de fusión (ΔTm = Tm, tratado-Tm, control) para cada proteína detectable. Sólo las proteínas más afectadas se seleccionan como posibles "éxitos" aplicando una prueba z ajustada por FDR a los datos de ΔTm. Las proteínas con un valor p <0,1 en dos réplicas técnicas separadas se consideran "aciertos". Los impactos encontrados en dos réplicas biológicas se consideran objetivos putativos.

El análisis de nuestros conjuntos de datos de TPP identificó 14 "aciertos" en la primera réplica biológica y 10 en la segunda (Datos complementarios 5). Sin embargo, la única proteína identificada como objetivo putativo en ambos conjuntos de datos fue PfACS10 (Fig. 6). Otras enzimas PfACS se identificaron con éxito en nuestros conjuntos de datos de TPP; su estabilidad térmica se mantuvo sin cambios en presencia de MMV897615. Debido a que el método Tm representa el enfoque más estricto y sólido para la identificación de "impactos", tenemos un alto grado de confianza en que PfACS10 interactúa directamente con MMV897615.

un diagrama de Venn de proteínas que muestra los cambios térmicos más significativos en presencia de MMV897615 de experimentos duplicados (réplicas biológicas). b Curva de fusión para PfACS10 después de la incubación con MMV897615 500 nM o vehículo (DMSO al 0,1%) en los dos experimentos independientes. El cambio medio en la temperatura de fusión (ΔTm) para PfACS10 fue de 4,13 °C. Los datos de los dos experimentos duplicados independientes se presentan en los Datos complementarios 5. c Western blot que muestra el lisado de proteínas de los parásitos ACS11cKD cultivados en presencia de aTc 500 nM. Los lisados ​​​​de proteínas se expusieron a MMV665924 y MMV019719 10 mM cada uno (+), o DMSO de control (-) durante 30 minutos a temperatura ambiente para probar el efecto de MMV665924 y MMV019719 sobre la estabilidad de las proteínas. Los lisados ​​se procesaron en un gel no desnaturalizante o en un gel SDS, se transfirieron a una membrana y se detectaron con anticuerpos anti-HA. No se pudo detectar ningún efecto de MMV665924 y MMV019719 sobre la dimerización. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. aTc anhidrotetraciclina.

Trabajos anteriores han demostrado que se ha descubierto que las mutaciones en PfACS11 confieren resistencia a múltiples inhibidores de la acetil-CoA sintetasa (AcAS)31,32,40 y que PfACS11 no es esencial para el crecimiento del parásito en etapa sanguínea asexual descrito en un modelo knockout de P. berghei34 y un Prueba de esencialidad de P. falciparum PiggyBac41. Nuestro trabajo aquí presentado demuestra que la resistencia la confieren las mutaciones seleccionadas por MMV665924 y MMV079179. Para investigar más a fondo el mecanismo de resistencia, probamos la susceptibilidad de los parásitos ACS11cKD y YFPcKD de control40 descritos anteriormente a MMV665924, MMV079179 y MMV897615 en presencia o ausencia de aTc. La reducción de los niveles de proteína PfACS11 resultó en un mayor nivel de resistencia a los tres fármacos (prueba t de Student p <0,001, datos complementarios 1 y figuras 5f-h). Curiosamente, incluso en presencia de aTc 50 nM, el ACS11cKD fue 2 veces resistente en comparación con el control YFP, tal vez debido a que la etiqueta HA resultó en la desestabilización de la proteína. Estos resultados sugieren que una reducción o desestabilización de la proteína PfACS11 podría impulsar el mecanismo de resistencia.

Más evidencia de desestabilización proviene del análisis de nuestro conjunto de datos del TPP. El análisis no paramétrico de las curvas de respuesta (NPARC), un método alternativo y quizás menos estricto para la identificación de aciertos, indicó que PfACS11 se desestabilizó en presencia de MMV897615 (Datos complementarios 5). A diferencia del método Tm de identificación de aciertos descrito anteriormente, NPARC tiene en cuenta toda la curva de fusión, comparando la bondad de ajuste de los datos experimentales con un modelo nulo que supone que la proteína no se ve afectada por el tratamiento farmacológico, o un modelo alternativo que supone que la proteína se ve afectada por el tratamiento. Se genera un valor p ajustado por FDR que denota la importancia del efecto del fármaco sobre el comportamiento de fusión de proteínas. En este estudio, las proteínas con un valor p de NPARC <0,01 se consideraron "aciertos" y los aciertos comunes a ambas réplicas biológicas se consideraron objetivos putativos. La desestabilización de una proteína puede indicar la alteración de un complejo o dímero proteico. Una transferencia Western con lisado de proteínas, preparado en condiciones no desnaturalizantes a partir de una línea de parásito ACS11cKD que expresaba PfACS11 marcado con HA, mostró una doble banda entre 140 y 260 kDa, mientras que una sola banda de alrededor de 100 kDa estaba presente en condiciones desnaturalizantes (Fig. 6c). Este resultado sugiere que PfACS11 puede oligomerizarse o formar un complejo con otras proteínas. Para probar si PfACS11 forma un complejo con otras proteínas PfACS u otros socios que interactúan, realizamos experimentos desplegables con trofozoítos ACS11cKD que expresan PfACS11 etiquetado con HA. Los resultados no revelaron ningún enriquecimiento significativo para ninguna proteína distinta de PfACS11 (Figura complementaria 3 y Datos complementarios 6). En conjunto, estos resultados sugieren que PfACS11 es un mediador de resistencia potencial, a diferencia de un objetivo directo, y que la resistencia probablemente esté mediada por la pérdida de función.

Los parásitos P. falciparum pueden eliminar una amplia gama de sustratos de FA del huésped durante el desarrollo de la etapa sanguínea asexual42. Por lo tanto, probamos el efecto de la eliminación de PfACS10 sobre la composición total de FA de los glóbulos rojos infectados mediante cromatografía de gases-detección de ionización de llama (GC-FID). Como se observó anteriormente43, la invasión parasitaria altera drásticamente la composición de AG de los eritrocitos, con un 60% de AG compuesto por sólo tres AG en los glóbulos rojos parasitados: 16% esteárico (18:0), 13% palmítico (16:0). y 30% de ácido oleico (18:1n-9c) (Datos complementarios 7 y 8).

Después de la eliminación de aTc, hubo reducciones pequeñas pero significativas en los ácidos esteárico, oleico y elaídico (18:1n-9t) en los parásitos ACS10cKD en comparación con los controles completos de aTc (media de reducciones de 15, 5 y 27% respectivamente, prueba t de Student no apareada). p <0,05, Fig. 7a y Datos complementarios 7). Estos datos sugieren que PfACS10 podría estar involucrado en la absorción y retención de AG con una longitud de cadena de acilo preferida de 18.

Los parásitos ACS10cKD se lavaron 24 h antes del enriquecimiento en trofozoítos mediante purificación MACS para permitir niveles reducidos de PfACS10. En estas condiciones de lavado de aTc, no hubo ningún defecto visible en la línea ACS10cKd. Los AG de eritrocitos infectados se extrajeron y se sometieron a detección por cromatografía de gases-ionización de llama (GC-FID); los resultados se normalizaron para la FA total. Se muestran la media ± DE de tres réplicas biológicas para ácidos grasos relevantes. b 3D7 y ACS10M300I_C se enriquecieron para trofozoítos jóvenes y se expusieron a MMV665924 10 mM o DMSO durante 10 h, después de lo cual los FA se extrajeron y analizaron mediante GC-FID. Se muestran las medias ± DE de cuatro réplicas biológicas para FA relevantes. La prueba de significancia utilizó la prueba t de Student bilateral no pareada, a: p = 0,006, b: p = 0,03, c: p = 0,02, d: p = 0,01. Los datos completos para el GC-FID están disponibles en los Datos complementarios 7 y 8. aTc anhidrotetraciclina, ácido graso FA.

Luego probamos si el tratamiento con uno de los compuestos cambia directamente la composición de FA en los eritrocitos infectados. Tras el tratamiento de los parásitos 3D7 con MMV665924, hubo una reducción significativa de los ácidos alfa-linoleico (18:3n-3c), linoleico (18:2n-6cc) y cis-vaccénico (18:1n-7c) (20, 18 y reducciones del 45% respectivamente, p <0,05 prueba t de Student no apareada, Fig. 7b), y un aumento significativo (28%) en el ácido heptadecanoico (17:0) (Datos complementarios 8). Por el contrario, cuando tratamos la línea ACS10M300I_C resistente con MMV665924, observamos un aumento del 16 % en el ácido araquidónico (20:4n-6c) pero no hubo una reducción significativa en ningún FA específico (p < 0,05 prueba t de Student no apareada, Datos complementarios 8) . El ácido alfa-linoleico y ruménico (18:2n-7ct) se redujeron significativamente en la línea ACS10M300I_C no tratada en comparación con 3D7 (12 y 46%, respectivamente, Fig. 7b y Datos complementarios 8). Al igual que en los experimentos de eliminación, los AG con una longitud de cadena de 18 carbonos fueron los más afectados.

Los parásitos P. falciparum pueden mantener un crecimiento limitado en “medios mínimos” que están esencialmente libres de AG, excepto el ácido palmítico (16:0) y oleico (18:1n-9c)44,45. Probamos si la suplementación de medios mínimos con algunos de los AG más reducidos por MMV665925 podría alterar la supervivencia del parásito bajo el tratamiento con MMV665924. De hecho, la adición de ácido linoleico (18:2n-6cc) y cis-vaccínico (18:1n-7c) aumentó significativamente la CE50 (el doble) en comparación con los medios mínimos (Figura complementaria 4, p <0,05 con un medio ordinario). forma ANOVA en comparación con el crecimiento en medios mínimos, seguido de la prueba posterior de Dunnett). La adición de ácido mirístico (14:0), palmitoleico (16:1n-7c) o esteárico (18:0) no tuvo un efecto significativo sobre la CE50 de MMV665924. Estos datos sugieren que MMV665924 podría inhibir la formación de ácidos linoleico y cis-vacínico, y que una fuente exógena puede rescatar el crecimiento del parásito.

Los parásitos Plasmodium modifican la composición lipídica de su entorno intracelular durante su ciclo de vida asexual y especialmente aumentan la cantidad de lípidos naturales (diacilgliceroles (DAG) y triacilgliceroles (TAG)) en los glóbulos rojos infectados21. Para investigar qué especies de lípidos se vieron afectadas por el tratamiento farmacológico, utilizamos análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Detectamos un total de 996 especies de lípidos, que podrían subdividirse en 27 subclases diferentes (Figura complementaria 5 y Datos complementarios 9). En general, observamos una reducción significativa del 20 al 24 % en los TAG y un aumento del 40 al 45 % en el ácido fosfatídico en ambas muestras de parásitos tratadas con fármacos en comparación con los controles tratados simuladamente con DMSO (MMV665924 y MMV897615, respectivamente, prueba t de Student no apareada p < 0,05, figura 8). El tratamiento con cualquiera de los compuestos provocó una respuesta similar (prueba t de Student no apareada p <0,05, figura complementaria 6 y datos complementarios 10).

Los trofozoitos 3D7 jóvenes se enriquecieron en función de su unión magnética a columnas MACS y se trataron con DMSO, MMV665924 10 mM o MMV897615 1 mM durante 8 h. Los lípidos se extrajeron y se enviaron para cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS). Se realizaron tres réplicas biológicas y los resultados de cada muestra se normalizaron con respecto a la composición lipídica total de la muestra. Los gráficos de volcanes que muestran especies de lípidos para parásitos tratados con DMSO frente a MMV665924 (a) o MMV897615 (b), especies de lípidos que son más de 2 veces diferentes y tienen un valor de p <0,05 (prueba t de Student no apareada bilateral) están sombreadas. c Cambios en las subclases de lípidos relevantes tras el tratamiento farmacológico en comparación con el control con DMSO. d Se analizó y comparó la contribución de cada especie individual de FA al conjunto total de TAG y se comparó entre el control de DMSO y los parásitos tratados con fármacos. Se muestran datos para las seis AF detectadas con mayor frecuencia. Los resultados se obtuvieron de tres réplicas biológicas y se muestran como medias ± DE. Las diferencias se probaron utilizando una prueba t de Student no pareada bilateral. a: p = 0,01, b: p = 0,006, c: p = 0,00009, d: p = 0,001, e: p = 0,04, f: p = 0,0002, g: p = 0,0003, h: p = 0,004, i: p = 0,003, j: p = 0,0008, k: p = 0,002, l: p = 0,008. Los datos completos están disponibles en los Datos complementarios 9 y 11 y en el archivo de datos fuente. Ácido graso FA, triacilglicerol TAG.

Los TAG tienen tres restos de FA y analizamos la contribución de cada especie de FA individual detectada en el conjunto total de TAG. Sólo seis especies de FA (18:1 16%, 16:0 10%, 18:0 9%, 16:1 6%, 18:2 5% y 18:3 5%) constituyeron más de la mitad del grupo de TAG. Comparamos la contribución de estos seis AG de parásitos tratados y no tratados (Fig. 8d). Curiosamente, las cuatro especies de AG de 18 carbonos fueron significativamente menos abundantes en los parásitos tratados en comparación con el control DMSO (prueba t de Student no apareada p <0,01), mientras que la cantidad de AG de 16 carbonos no se vio afectada. Estos resultados son consistentes con los datos de GC-FID, donde también observamos la mayor reducción en FA con 18 carbonos. Estos datos combinados sugieren que el tratamiento con MMV665924 o MMV897615 inhibe la incorporación de FA de 18 carbonos en los TAG recién formados.

Para investigar más a fondo la actividad biológica de MMV019719, MMV665924 y MMV897615 en parásitos en etapa sanguínea asexual, determinamos la etapa de vida en la que los compuestos eran más potentes. Expusimos parásitos sincronizados a cada compuesto durante ventanas de 12 h a tres concentraciones diferentes durante un ciclo celular intraeritrocítico y medimos la parasitemia durante todo el ciclo siguiente (Fig. 9 y Figs. 7 y 8 complementarias). Todos los compuestos mostraron la mayor actividad contra los trofozoítos (24 a 36 h y 36 a 48 h después de la invasión) y una actividad mínima contra las primeras etapas del anillo (0 a 12 h). Los parásitos tratados 24 h después de la invasión formaron esquizontes anormales que no progresaron al siguiente ciclo (Figura complementaria 7). Esta observación es consistente con los niveles de transcripción de PfACS10 y PfACS11, que alcanzan su punto máximo en las últimas etapas del desarrollo de la etapa sanguínea asexual46,47,48 (http://plasmodb.org49,50) cuando la demanda de AG es máxima.

Se expusieron parásitos de 0 a 6 h durante períodos de 12 h a tres concentraciones diferentes del compuesto (baja, intermedia y alta). Se tomaron frotis antes de la adición del fármaco (inicio) y cada 12 h después de la exposición al fármaco. En la figura complementaria 4 se muestran imágenes representativas de la concentración intermedia. La parasitemia se midió mediante citometría de flujo cada 12 h y en el segundo ciclo de vida para determinar los parásitos viables, como lo indica un aumento de la parasitemia. Se puede observar que la parasitemia aumenta a las 48 h en el control de DMSO no tratado, así como para los parásitos tratados entre 0 y 12 h para MMV665924 y MMV897615 en todas las concentraciones analizadas y en concentraciones intermedias y bajas para MMV019719. El tratamiento de concentraciones intermedias también resultó en un aumento de los parásitos expuestos a las 12-24 h. La exposición a concentraciones altas y medias después de 24 h inhibió casi por completo el crecimiento. Se contaron 100.000 células por punto de tiempo y en la figura complementaria 8 se muestra un ejemplo de la estrategia de activación. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Aquí, demostramos que las mutaciones en PfACS10 y PfACS11, dos miembros de la familia de acil-CoA sintetasa en P. falciparum, causan una sensibilidad reducida a tres compuestos novedosos y químicamente distintos (MMV665924, MMV019719 y MMV897615). Se predice que las mutaciones en PfACS10 recubren el bolsillo de unión de FA, lo que sugiere que los compuestos podrían interferir con la unión del sustrato. Mostramos que PfACS10 es esencial en los parásitos en etapa sanguínea asexual mediante eliminación condicional y demostramos que PfACS10 interactúa directamente con MMV786519 mediante TPP. Las enzimas ACS son responsables de la activación de los AG libres necesarios para una variedad de procesos biológicos, y demostramos que el tratamiento farmacológico conduce a un nivel reducido de TAG y una acumulación en el ácido fosfatídico precursor de lípidos y DAG. Estos hallazgos resaltan una nueva vulnerabilidad del parásito que es susceptible de descubrimiento de fármacos antipalúdicos21. El uso de inhibidores de SCA como compuestos terapéuticos se ha explorado en el tratamiento del cáncer51 así como en parásitos como Giardia52 y Cryptosporidium parvum53. Más importante aún, el inhibidor de PfACS10 MMV1582367 (GSK701) se encuentra en un ensayo clínico de fase I para el tratamiento de la malaria no complicada (NCT05507970).

En P. falciparum, la familia de genes PfACS está ampliada13, en comparación con otros organismos eucariotas. El repertorio funcional ampliado de esta familia ampliada no está completamente delineado, pero trabajos previos que incluyen una prueba de transposón PiggyBac41 apuntan a PfACS10 como un gen esencial. Además, nuestros estudios de eliminación condicional demuestran directamente la esencialidad de este gen para el crecimiento de parásitos asexuales en cultivo.

Varias líneas de evidencia apuntan a un papel de la proteína PfACS11 en conferir resistencia a través de un mecanismo de pérdida de función. Los estudios de reemplazos alélicos demuestran que las mutaciones confieren resistencia y la eliminación condicional de la proteína PfACS11 en un 80% (como lo establecieron previamente Summers et al.40) resultó en resistencia a los tres compuestos. Los parásitos ACS11cKD cultivados sin aTc mostraron una reducción del 20% en el crecimiento, lo que sugiere que PfACS11 no es esencial en etapas asexuales in vitro. Sin embargo, es posible que sea necesaria una reducción más fuerte del nivel de proteínas para inhibir el crecimiento del parásito, como se ha demostrado con la plasmepsina V54. PfACS11 también juega un papel en conferir resistencia no solo a los compuestos reportados aquí sino también a las pantotenamidas31 y MMV01972140 que se dirigen a la acetil-CoA sintetasa, que activa el acetato en lugar de los AG. El etiquetado del locus PfACS11 hizo que los parásitos fueran más resistentes a MMV665924, MMV019719 y MMV897615, así como a MMV01972140. Se ha demostrado para otras proteínas que la adición de aptámeros 3' puede reducir sustancialmente los niveles de proteína, incluso en presencia de aTc33 500 nM. Especulamos que la pérdida de la función PfACS11 podría conferir una menor sensibilidad a estos compuestos. Curiosamente, el análisis NPARC de TPP detectó una disminución en la estabilidad de PfACS11 en presencia de MMV897615, lo que puede indicar la desestabilización de un complejo proteico mediante la interacción directa con el compuesto. Las enzimas ACS a menudo funcionan como dímeros14,55,56 y la transferencia Western de un gel nativo sugiere que PfACS11 podría formar un homodímero (Fig. 6c). No hemos encontrado ninguna evidencia basada en desplegables de PfACS11 que interactúen directamente con cualquiera de los otros doce PfACS, ni con ninguna otra proteína (Figura complementaria 3, Datos complementarios 6). En general, nuestros hallazgos sugieren que, si bien los compuestos pueden interactuar directamente con ambas enzimas, el efecto inhibidor del crecimiento primario de MMV665924, MMV019719 y MMV897615 se deriva de su unión al bolsillo de unión de FA de PfACS10 en lugar de la desestabilización de PfACS11. Por lo tanto, PfACS11 es interesante en términos de su función biológica, pero es un objetivo farmacológico menos convincente, y se necesitan más estudios para comprender su papel en la resistencia.

Como las mutaciones que causan resistencia parecen revestir el bolsillo de unión de FA de PfACS10, proponemos que los compuestos interfieran con la capacidad de PfACS10 para activar los FA libres. Los SCA pueden activar una variedad de AG y, a menudo, son específicos de la longitud de la cadena de acilo15,16,17,18. La expresión individual de ACSL también se ha correlacionado con los niveles individuales de acil-CoA en células de mamíferos57. Hemos demostrado que una caída de PfACS10 conduce a una reducción de los ácidos esteárico y oleico endógenos (algunos de los AG más abundantes en el parásito), lo que sugiere una preferencia de PfACS10 por la longitud de FA C18. El tratamiento con MMV665924 condujo a una reducción del ácido linoleico, alfa-linoleico y cis vaccénico, que puede derivarse directamente de la desaturación del ácido esteárico y oleico tras la activación por un SCA. Las discrepancias en las especies específicas de C18 FA que cambian entre la eliminación y el tratamiento farmacológico podrían reflejar diferentes tiempos y duración de las perturbaciones. También es posible que la interrupción de PfACS10 pueda alterar el tráfico subcelular de FA, lo que no pudo evaluarse aquí. Se necesitan más estudios funcionales de PfACS10 para confirmar la especificidad del sustrato y la función de PfACS10.

Además de las especies de FA, también investigamos las especies de lípidos más afectadas por los compuestos. El tratamiento de los parásitos trofozoítos tempranos con MMV665924 o MMV897615 condujo a una disminución significativa de los TAG. Curiosamente, los restos de FA más agotados en los TAG (longitud de 18 carbonos) también fueron los más afectados en el análisis de FA total mediante GC-FID. Se ha demostrado un papel del SCA en la formación de TAG en células de cáncer de próstata donde la eliminación de ACSL1 dio lugar a niveles reducidos de TAG57. La desfosforilación del ácido fosfatídico produce DAG que luego se puede convertir en TAG mediante la adición de una acil-CoA. Observamos un aumento de ácidos fosfatídicos y DAG, que podría ser un resultado directo de la disminución de TAG. Se ha demostrado que el ácido fosfático desempeña un papel importante en la homeostasis de los lípidos y la formación de gotitas de lípidos58. Una reducción de los TAG al final del desarrollo de la etapa sanguínea asexual podría conducir a menos gotas de lípidos en el parásito, lo que resultaría en una falta de AG almacenados necesarios para los procesos celulares, incluida la generación de precursores de membrana para la formación de merozoítos durante la esquizogonia. De hecho, los parásitos en etapa tardía tratados con cualquiera de los tres compuestos no logran formar merozoitos adecuados, lo que indica un defecto en la formación de la membrana.

Nuestro trabajo aquí presenta a PfACS10 como un objetivo novedoso para los antipalúdicos, pero que podría tener posibles riesgos de resistencia. Observamos un alto grado de variación y divergencia genética dentro y entre PfACS10 en genomas de poblaciones de parásitos P. falciparum de diversas ubicaciones geográficas, lo que indica que este locus puede ser vulnerable a la selección en caso de que se implementen inhibidores específicos en el futuro. De hecho, se esperaba que ocurrieran varias variantes no sinónimas dentro de los sitios de unión del sustrato (y compuesto) previstos de PfACS10, incluida la presencia de la variante M300I, que se encuentra con una alta frecuencia de alelos en Malawi. Los aislados de Malawi que portaban esta variación fenocopiaron los niveles de resistencia a MMV665924 observados en las líneas ACS10M300I_S y ACS10M300I_C. Sin embargo, para demostrar de manera concluyente el papel de M300I en la resistencia a MMV665924 en aislados de Malawi, será necesaria la conversión de la mutación M300I a WT en aislados de Malawi mediante edición CRISPR/CAS9. Las variaciones de PfACS10 no se han asociado con ninguna terapia antipalúdica actual o previa, lo que sugiere que el locus puede estar bajo presión selectiva debido a factores relacionados con el huésped (humano o mosquito), como el metabolismo. Sin embargo, se observaron muy pocas mutaciones en PfACS11 en poblaciones de parásitos naturales. Esto podría indicar que PfACS11 no está bajo selección diversificada en el campo o que su función está más conservada y podría ser esencial para la transmisión en el mosquito o en la supervivencia en la etapa hepática.

La diversidad genética de PfACS10 y su capacidad para tolerar mutaciones también podrían aprovecharse. Las mutaciones en PfACS10 en dos líneas de parásitos que se seleccionaron con MMV897615 fueron 2,5 veces más sensibles a MMV665924 o 8,5 veces más sensibles a MMV019719 (ACS10A268V_S y ACS10A268D_S respectivamente). Este fenómeno recuerda a la sensibilidad colateral, donde la resistencia a un fármaco aumenta la susceptibilidad a otro, como se ha demostrado en bacterias (revisado en59) y se estudia en el tratamiento del cáncer60. También se ha demostrado sensibilidad colateral en P. falciparum a la dihidroorotato deshidrogenasa61 y a los inhibidores del proteasoma9,62, así como a los inhibidores de la dihidrofolato reductasa en P. vivax63. El uso simultáneo o secuencial de distintos inhibidores de PfACS10 podría reducir la aparición de resistencia o matar los parásitos resistentes de manera más efectiva, lo que convierte a esta enzima en un objetivo deseable.

MMV019719, MMV665924 y MMV897615 estaban disponibles gratuitamente como parte de la Malaria Box de Medicines for Malaria Venture (MMV). La triacsina C se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ref. T4540). La cepa 3D7 P. falciparum se obtuvo originalmente a través de MR4 como parte del Repositorio de Recursos BEI, NIAID, NIH: 3D7, MRA-102, depositado por DJ Carucci. También utilizamos 3D7-IG06 (un clon 3D7 de rápido crecimiento)64 donado por Daniel Goldberg y Dd2-Polδ23 donado por Marcus Lee. Los parásitos de Malawi (CF04.008 10B y CF04.009 6D y 1 G, dos aislamientos de pacientes diferentes que fueron subclonados después de la adaptación del cultivo) fueron donados amablemente por Danny Milner26. Los parásitos se cultivaron mediante métodos estándar65 en medio RPMI 1640 suplementado con NaHCO3 28 mM, HEPES 25 mM, hipoxantina 400 μM, gentamicina 25 μg/ml y AlbuMAX II al 0,5 % (Life Technologies, Carlsbad, CA 11021-045). Los eritrocitos humanos se obtuvieron de forma ética y su uso en investigación se realizó de acuerdo con los términos del protocolo aprobado.

Se generaron dos tipos de plásmidos para la transfección de líneas parentales 3D7. Se utilizó el vector pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR66 para generar una rotura bicatenaria específica y un vector pGEM-3z (Promega, Madison, WI, EE. UU.) con la región de homología que contiene el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de interés y ARN guía codificados (ARNg) como plantilla de reparación. Los ARNg se diseñaron mediante evaluación comparativa (Benchling, Inc.) y se solicitaron como cebadores de Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, Iowa, EE. UU.) con salientes compatibles con los salientes de BbsI en pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR. El plásmido pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR se digirió con BbsI y se ligó con los ARNg hibridados. Para generar el plásmido plantilla de reparación, se amplificaron aproximadamente 500 pares de bases que rodean el SNP de interés a partir del ADNg de los parásitos 3D7 y se ligaron al vector pGEM-3z usando HincII. El SNP de interés y la codificación de los ARNg se introdujeron con el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5® (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los parásitos en etapa de anillo sincronizados con sorbitol se sometieron a electroporación utilizando un Bio-Rad Gene Pulser (Biorad, Hercules, CA) y condiciones de 0,31 kV y 960 µF con un total de 100 µg de plantilla de plásmido y dos plásmidos pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR con dos gRNA diferentes en citomezcla incompleta utilizando una cubeta de 0,2 cm. Las líneas de parásitos transfectadas resultantes se clonaron mediante dilución limitante y se secuenciaron mediante secuenciación de Sanger para confirmar la edición genética exitosa. Las secuencias de ARNg y cebadores utilizados se indican en la Tabla complementaria 1.

La sensibilidad a los medicamentos in vitro de los parásitos en estadio sanguíneo asexual se determinó utilizando un ensayo de proliferación celular basado en SYBR Green I-(Life Technologies, S7567)67. Se llevaron a cabo series de diluciones de curvas de doce puntos del compuesto de prueba por triplicado el mismo día y se replicaron en al menos tres días diferentes. Los valores de EC50 se calcularon utilizando el ajuste de curvas de regresión no lineal en Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

Para complementar los estudios de FA mínimos, los parásitos se resuspendieron en un medio mínimo que se generó complementando RPMI-1640 con BSA libre de ácidos grasos al 0,39% y ácido oleico y palmítico (30 μM cada uno; agregados a partir de soluciones madre disueltas en etanol 30 mM; todos de Sigma-Aldrich). Se agregaron ácidos linoleico, cis vaccénico, mirístico, palmitoleico y esteárico a 30 μM cada uno (agregados a partir de reservas disueltas en etanol 30 mM, todas de Sigma-Aldrich).

Inicialmente se determinó que la CE50 era 32,7 nM en P. falciparum Dd2-Polδ23. Se configuró una selección de un solo paso utilizando parásitos clonales 1E9 Dd2-Polδ por duplicado a una concentración inicial de 3 x EC50 (98 nM). La presión del fármaco aumentó gradualmente cuando los parásitos permanecieron sanos en la concentración inicial. El día 7, la presión del fármaco alcanzó su punto máximo (198 nM) y los parásitos desaparecieron. Poco después, el día 14, los parásitos en ambos matraces recrudecieron. Estos parásitos se mantuvieron bajo la dosis máxima del fármaco durante el cultivo.

Para definir la CE50 de los parásitos, se expusieron cultivos en etapa de anillo con 0,2% de parasitemia y 1% de hematocrito durante 72 h a un rango de diez concentraciones de fármaco que se diluyeron en serie dos veces por duplicado junto con controles de DMSO. La supervivencia del parásito se evaluó mediante citometría de flujo en un citómetro de flujo iQue (Sartorius) utilizando SYBR Green y MitoTracker Deep Red FM (Life Technologies) como tinción nuclear y tintes vitales, respectivamente.

La secuenciación del genoma completo de los parásitos clonales seleccionados MMV897615 se realizó utilizando el kit de biblioteca de ADN Nextera Flex y se multiplexó en una celda de flujo MiSeq para generar lecturas de extremos emparejados de 300 pb. Las secuencias se alinearon con el genoma de referencia de Pf3D7 (PlasmoDB-48_Pfalciparum3D7; https://plasmodb.org/plasmo/app/downloads/release-48/Pfalciparum3D7/fasta/) utilizando Burrow-Wheeler Alignment (BWA versión 0.7.17). Los duplicados de PCR y las lecturas no asignadas se filtraron utilizando Samtools (versión 1.13) y Picard MarkDuplicates (GATK versión 4.2.2). Las puntuaciones de calidad base se recalibraron utilizando GATK BaseRecalibrator (GATK versión 4.2.2). Se utilizó GATK HaplotypeCaller (GATK versión 4.2.2) para identificar todas las posibles variantes de un solo nucleótido en líneas de parásitos de prueba filtradas en función de las puntuaciones de calidad (calidad de la variante en función de la profundidad QD > 1,5, calidad del mapeo > 40, puntuación de calidad base mínima > 18, profundidad de lectura> 5) para obtener SNP de alta calidad que se anotaron utilizando SnpEff versión 4.3t68. Se utilizó la versión 1.1.269 de BIC-Seq para descubrir variantes del número de copias (CNV) contra la cepa parental utilizando el modelo estadístico bayesiano. Los SNP y CNV se inspeccionaron y confirmaron visualmente utilizando Integrative Genome Viewer (IGV). Todas las anotaciones genéticas en el análisis se basaron en PlasmoDB-48_Pfalciparum3D7 (//plasmodb.org/plasmo/app/downloads/release-48/Pfalciparum3D7/gff/).

Los cálculos de diversidad de genes en Senegal y Malawi se realizaron como se describió anteriormente70. En resumen, las llamadas a SNP de todo el genoma se obtuvieron del proyecto Pf3k (versión 5; www.malariagen.net/projects/pf3k). Se determinó que 99 muestras de Senegal y 110 de Malawi derivaban de infecciones de un solo clon según las tasas de llamadas heterocigotas (ya sea ≥2 % de llamadas heterocigotas o ≥4 % de llamadas perdidas) y se retuvieron para análisis posteriores. Las variantes dentro de estas muestras se enmascararon si fallaban en algún filtro GATK, faltaban en >25 % de las muestras o mostraban altos niveles de heterocigosidad dentro de infecciones individuales (>25 %). Además, 558 genes no pasaron los filtros de calidad a nivel genético (≥20% de llamadas heterocigotas o ≥20% de llamadas faltantes en todas las muestras) y se eliminaron del análisis. Los cálculos de la diversidad de nucleótidos por pares (π) y el estimador FST de Weir y Cockerham se realizaron con el paquete PfalGeneDiversityStats71.

Las predicciones estructurales de las proteínas PfACS10 y PfACS11 se obtuvieron de la base de datos AlphaFold27,72, versión AlphaFold DB 2022-06-01, creada con la tubería AlphaFold Monomer v2.0). El algoritmo AlphaFold incorpora restricciones evolutivas, físicas y geométricas utilizando arquitecturas de redes neuronales para predecir estructuras de proteínas. Las imágenes se renderizaron utilizando Pymol 2.5.3.

Para generar los vectores donantes para la regulación inducible de la expresión de PfACS10 (PF3D7_0525100), las regiones de homología derecha (RHR) se amplificaron mediante PCR utilizando los cebadores enumerados en la Tabla complementaria 1, y junto con las regiones de homología izquierda (LHR) y los fragmentos de ARNg individuales sintetizados utilizando el sistema BioXP™ 3200 (SGI-DNA, San Diego, CA) se clonaron en el vector basado en el sistema pJazz, pSN05473. Las características de este vector incluyen (i) etiquetas de epítopo C-terminal V5 y 2x-hemaglutinina (HA) en el marco del gen diana seguido de una matriz de aptámeros 10X; (ii) un casete TeTR-DOZI que contiene la blasticidina S-desaminasa para la selección en los parásitos, el gen indicador Renilla luciferasa (RLuc) y las proteínas de fusión reguladoras TetR-DOZI, todas expresadas bajo el promotor PfHsp86 y el terminador PfHrp2; y (iii) un casete de expresión de ARNg con promotor y terminador T7. La generación del vector donante se llevó a cabo mediante ensamblaje de Gibson, y la secuencia de la construcción final se verificó y se confirmó adicionalmente mediante resúmenes de restricción.

La transfección en parásitos se llevó a cabo precargando eritrocitos con el vector lineal ACS10_pSN054 como se describió anteriormente74. Brevemente, se mezclaron 50 μg de ADN plasmídico purificado con glóbulos rojos humanos y se sometieron a 8 pulsos de electroporación de onda cuadrada de 365 V durante 1 ms cada uno, separados por 0,1 s en una cubeta de 0,2 cm. Las células precargadas con ADN plasmídico se inocularon con NF54 que expresa Cas9 y ARN polimerasa T7, se mantuvieron en anhidrotetraciclina 500 nM (aTc, ref no 37919 Sigma-Aldrich) y se seleccionaron fármacos con 2,5 μg/ml de blasticidina (ref no B12150-0.1 RPI Corp. , Mt Prospect, IL) se inició cuatro días después de la transfección. La aparición de parásitos transfectados se controló mediante frotis de Giemsa y mediciones de RLuc. Aunque las transfecciones con ACS10_pSN054 inicialmente fallaron, la eliminación de las etiquetas de epítopo dio como resultado transfecciones exitosas.

La evaluación de la tasa de proliferación del parásito durante dos ciclos de desarrollo intraeritrocítico mediante la titulación de la expresión de PfACS10 e YFP se llevó a cabo manteniendo los cultivos en concentraciones variables de aTc y utilizando luminiscencia como lectura del crecimiento. En una placa BD Falcon™ con fondo en U de 96 pocillos, los parásitos en etapa de anillo sincrónicos se configuraron por triplicado y se cultivaron en presencia (50 y 3 nM) o ausencia de aTc. La expansión se midió a las 0, 72 y 120 h cuantificando la luminiscencia utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Renilla-Glo(R) (n.º de referencia E2750, Promega) y el lector de microplacas multimodo GloMax® Discover (Promega). Los valores de luminiscencia se normalizaron para muestras tratadas con cloroquina (200 nM) y los resultados se visualizaron en un diagrama de dispersión utilizando GraphPad Prism (versión 8; software GraphPad).

Los parásitos ACS11cKD sincronizados se sedimentaron 40 h después de la invasión y se resuspendieron en saponina al 0,03% en PBS 1 × a 4 ° C durante 15 minutos. Los pellets se lavaron 4 veces en 10 volúmenes de PBS frío con inhibidor de proteasa y se resuspendieron en PBS que contenía inhibidor de proteasa (n.º de referencia 4693159001, Sigma). La mitad de la muestra se transfirió a un tubo nuevo y se incubó con MMV665924 y MMV019719 10 μM cada uno a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mitad de cada muestra se volvió a colocar en un tubo nuevo y se mezcló solo con tampón Laemmli (n.º de referencia 1610737, BioRad) para condiciones no reductoras o tampón Laemmli que contenía 2-mercaptoetanol para condiciones reductoras. Las muestras de proteínas se procesaron en geles prefabricados Mini-PROTEAN® TGX™ (gradiente de 4 a 20 %, BioRad) solo en tampón de tris-glicina (no reductor) o con SDS para condiciones reductoras. Las proteínas separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Life Technologies, IB3010-31) usando el sistema iBlot (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se bloquearon con tampón de bloqueo Intercept® (TBS) (LI-COR Biosciences) durante la noche. . Las proteínas unidas a la membrana se sondaron con anticuerpo primario anti-HA de ratón (1: 1000; Sigma-Aldrich, H3663) y anti H3 de conejo (1: 1000 Histona H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb, tecnología de señalización celular, 4499 S). y anticuerpos secundarios anti-ratón (IRDye® 680RD de cabra anti-ratón, 926-68070, LI-COR) y anti-conejo (IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit, 926-32211, LI-COR). Se tomaron imágenes de transferencias de proteínas y se analizaron utilizando el sistema LI-COROdyssey CLx Imager (LI-COR Biosciences) e Image Studio ™ Lite (versión 5.2.5).

Para los estudios de coinmunoprecipitación, los parásitos ACS11cKD (250 ml con 3% de parasitemia y 5% de hematocrito) se sincronizaron con sorbitol, se lavaron y se cultivaron en presencia (500 nM) o ausencia de aTc, y se recogieron en la etapa de esquizonte (32 –42 h post invasión). En el momento de la recolección, los eritrocitos se lisaron en saponina al 0,05% en PBS con un cóctel de inhibidor de proteasa sin EDTA (cOmplete mini, Sigma) y se lavaron con PBS que incluía inhibidores de proteasa para eliminar el material de eritrocitos residual. Los gránulos de parásito se lisaron en tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, dodecilsulfato de sodio al 0,1%, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, mini inhibidores de proteasa completos sin EDTA (n.º de referencia 4693159001, Sigma ) durante 1 h, se sonicó tres veces con una amplitud del 25% durante 30 s cada 3 min y se centrifugó a 12.000 g durante 30 min para recoger el sobrenadante como proteína soluble. Las soluciones de proteínas se aplicaron a 40 μl de perlas magnéticas anti-HA (ref. no 88836, Pierce) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron cuatro veces con tampón RIPA, seguido de cuatro veces con bicarbonato de amonio 50 mM, se resuspendieron en 40 μl de bicarbonato de amonio y se sometieron a digestión en perlas seguida de péptido. identificación por LC-MS/MS.

Para los experimentos de TPP, los cultivos se mantuvieron a un hematocrito de entre 1,5 y 2,0 % con cambios de medio diarios o dos veces al día. Una vez que los cultivos alcanzaron entre un 8% y un 15% de parasitemia y fueron trofozoítos tardíos, los eritrocitos infectados se aislaron mediante separación MACS utilizando un imán SuperMACS II junto con una columna D (Miltenyi Biotec). Los sedimentos de eluato se resuspendieron en 10 ml de medio completo y se incubaron en fármaco a 10 × EC50 o diluyente (DMSO) durante 1 h a 37 °C en una atmósfera humidificada de 1 % de O2, 3 % de CO2 en un equilibrio de N2. La presión del fármaco se mantuvo durante el resto del procesamiento de la muestra. Después de la centrifugación, los eritrocitos parasitados se lisaron mediante incubación en saponina al 0,1% (p/v) en hielo durante 10 minutos con mezcla suave. El sedimento se lavó 3 veces en tampón de lavado (WB; acetato de potasio 100 mM, acetato de magnesio 2,5 mM, HEPES 45 mM [pH 7,4], sacarosa 250 mM, ditiotreitol 2 mM, leupeptina 15 µM) para eliminar el material de glóbulos rojos lisados. El sedimento se resuspendió en un volumen de WB suplementado con 0,8% (v/v) de n-octilglucósido e inhibidor de proteasa (inhibidor de proteasa sin EDTA completo de Roche; 1 tableta/20 ml) y los parásitos se lisaron mediante cavitación de nitrógeno (Parr) ( 4 °C, 1500 psi, 60 min). El lisado resultante se centrifugó (100.000 xg, 20 min, 4 °C), se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de proteína del lisado utilizando el ensayo de proteínas Bio-Rad.

Los ensayos de TPP se realizaron como se describió anteriormente75. Sin embargo, en este caso los lisados ​​se expusieron a 8 temperaturas: 37, 42, 47, 52, 57, 62, 67 y 72 °C.

La digestión de proteínas se realizó como se describió anteriormente75. Luego, las muestras se secaron al vacío y se resuspendieron en TEAB 100 mM (100 µl) antes de la incubación con sus respectivos reactivos Tandem Mass Tag™ (TMT pro) de 16 plex (Thermo) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Las reacciones se inactivaron mediante la adición de 5 % (v/v) de hidroxilamina durante 15 minutos, y luego cada conjunto de muestras (tratadas y vehículo) se agruparon y se secaron durante la noche. Las muestras marcadas con TMT se secaron y desalinizaron como se describió anteriormente75, luego se mantuvieron a -80 °C hasta su posterior análisis. El fraccionamiento de la muestra se realizó como se describió anteriormente75, pero con un gradiente diferente adaptado a los péptidos pro-marcados con TMT: 2% de tampón B a 20% de B en 8 minutos y luego de 20% de B a 40% de B en 37 minutos. La columna se lavó durante 15 min con tampón B al 100 % y se volvió a equilibrar con tampón B al 2 % durante 20 min.

El análisis de péptidos se realizó en un espectrómetro de masas Orbitrap Eclipse (Thermo Scientific) acoplado a un Dionex Ultimate 3000 RS (Thermo Scientific). La HPLC en línea se realizó como se describió anteriormente75. Orbitrap Eclipse se utilizó en modo dependiente de datos. Un ciclo de escaneo comprendía un escaneo MS1 (rango m/z de 380 a 1500, con un tiempo máximo automático de inyección de iones, una resolución de 120 000 y un valor objetivo de control automático de ganancia (AGC) estándar) seguido de escaneos MS2 secuenciales dependientes (con un aislamiento). ventana establecida en 0,7 Da, tiempo máximo de inyección de iones a 50 ms y objetivo de AGC estándar) y escaneos MS3 (con una resolución de 50.000, una ventana de aislamiento establecida en 0,7 Da, tiempo máximo de inyección a 120 ms y objetivo de AGC del 400%). La función de búsqueda en tiempo real estuvo activa durante el análisis.

El análisis de los datos de MS resultantes se realizó utilizando el software MaxQuant (//maxquant.org/, versión 2.0.3.0). Las modificaciones, digestiones y configuraciones de búsqueda en la base de datos se realizaron como se describió anteriormente. El modo MS3 del ion informador se seleccionó utilizando las etiquetas TMT-16plex en el extremo N y lisina. La tolerancia de masa de FTMS MS/MS se ajustó a 10 ppm y la tolerancia de masa de ITMS MS/MS fue de 0,5 Da.

Los experimentos de TPP se analizaron utilizando el paquete TPP disponible en Bioconductor, como se describió anteriormente39,75,76. Brevemente, la abundancia de proteína cruda, calculada a partir de las intensidades de iones indicadores normalizadas de todas las proteínas cuantificadas, se normalizó a la abundancia de proteína a la temperatura más baja para cada condición y réplica. Las curvas de fusión se calcularon utilizando un algoritmo de ajuste sigmoidal en el programa R del paquete TPP. Este ajuste se utilizó para determinar el punto de fusión (Tm), que se define como la temperatura a la que se desnaturalizó la mitad de la proteína. Las diferencias de punto de fusión (ΔTm) se calcularon restando los valores de Tm de la muestra tratada y no tratada. Las curvas de fusión sigmoideas se filtraron de acuerdo con los siguientes criterios: las curvas de fusión deben alcanzar una meseta de abundancia relativa <0,3 y el coeficiente de correlación (R2) debe ser >0,8. La significación estadística se calculó mediante una prueba z y solo las proteínas con un valor p <0,2 en ambas réplicas técnicas se consideraron acertadas. Los impactos encontrados en dos réplicas biológicas se consideraron objetivos putativos. Alternativamente, utilizamos el método NPARC (análisis no paramétrico de curvas de respuesta), una estrategia que compara los datos experimentales con dos modelos: un modelo nulo que supone que el fármaco no tiene influencia en el comportamiento de fusión de las proteínas y un modelo alternativo que supone ese fármaco afecta el comportamiento de fusión. Cualquier ajuste basado en datos a estos modelos se calculó y evaluó para determinar su significancia estadística mediante una prueba F, generando un valor de p. Todos los conjuntos de datos de TPP generados con MMV897615 se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE77 con el identificador PXD034937.

Para determinar si el tratamiento de los parásitos con MMV665924 tuvo una influencia en la composición de FA, se aislaron parásitos 3D7 de tipo salvaje o ACS10M300I_C altamente sincronizados utilizando un imán quadroMACS ™ con columnas LD (130-042-901, Miltenyi Biotec) aproximadamente 32 h después de la invasión. Luego, los parásitos se expusieron a 10 μM de MMV665924 durante 10 h en medio completo, después de lo cual los parásitos se lavaron tres veces con 1 × PBS y se almacenaron a -80 °C para su posterior extracción.

Para probar el efecto a corto plazo de la eliminación de PfACS10, se sincronizaron los parásitos con las líneas de eliminación condicional y se eliminó la aTc aproximadamente 20 h después de la invasión lavando los parásitos tres veces en RPMI incompleto durante 5 minutos. Luego, los parásitos se devolvieron a medios que contenían aTc 500 nM (control) o se cultivaron en ausencia de aTc durante 24 h, después de lo cual se purificaron usando un imán MACS como se describió anteriormente. Se enviaron aproximadamente 108 células para cada muestra determinada mediante recuento celular en el MACSQuant VYB (Milteni Biotec).

La extracción de muestras, la cromatografía y el análisis de datos se realizaron en las instalaciones centrales GC-FID del Departamento de Nutrición (Escuela de Salud Pública TH Chan de Harvard, Boston, MA). Brevemente, los lípidos totales se extrajeron de los eritrocitos en isopropanol y hexano que contenían 50 mg de 2,6-diterc-butil-p-cresol como antioxidante78. Los AG se transmetilaron con metanol y ácido sulfúrico como se describe79,80. Después de la esterificación, las muestras se evaporaron y los ésteres metílicos de FA se redisolvieron en isooctano. Los FA se separaron utilizando un cromatógrafo de gases FID GC 6890 modelo Hewlett-Packard (ahora Agilent) con un inyector Autosampler 7673 (Palo Alto, CA), un puerto de inyección splitless a 240 °C y un gas portador de hidrógeno de flujo constante a 1,3 ml/min. Se inyectó 1 µl de muestra en una columna cis/trans capilar de sílice fundida SP2560, 100 metros x 250 µm de diámetro interno x película de 0,20 µm (Supelco, Belefonte, PA), y se ejecutó a través de un programa de temperatura de 90 a 170 °C a 10 °C/min, 170 °C durante 5 min, 170 a 175 °C a 5 °C/min, 175 a 185 °C a 2 °C/min, 185 a 190 °C a 1 °C/min, 190 a 210 a 5 °C/min, 210 °C durante 5 min, 210 a 250 °C a 5 °C/min y 250 °C durante 10 min. Los tiempos máximos de retención se identificaron inyectando estándares conocidos con rangos de pureza superiores al 99 por ciento (NuCheck Prep, Elysium, MN), utilizando el software ChemStation A.08.03 de Agilent Technologies para el análisis. Con esta metodología se pueden identificar un total de 45 AF.

Para el perfil de lípidos, se aislaron parásitos de tipo salvaje 3D7 altamente sincronizados utilizando un imán quadroMACS ™ con columnas LD (130-042-901, Miltenyi Biotec) aproximadamente 32 h después de la invasión. Luego, los parásitos se expusieron a 10 μM de MMV665924 o 1 μM de MMV9897615 durante 8 h en medio completo, después de lo cual los parásitos se lavaron tres veces con 1x PBS y se establecieron recuentos celulares en un MACSQuant VYB (Milteni Biotec).

Usando pipetas de vidrio, los sedimentos de parásitos se resuspendieron en 200 µl de dH2O y luego se transfirieron a un vial de vidrio (VWR 66011-550) y se homogeneizaron en 2 ml de metanol. Luego se agregaron cuatro ml de cloroformo y la solución se agitó vigorosamente durante 1 min. Se añadieron 1,8 ml de H2Od y se agitó vigorosamente durante 1 min. Los viales se centrifugaron durante 10 minutos a aproximadamente 3000 rcf. La fase de cloroformo del fondo se transfirió a un vial de vidrio nuevo y se almacenó a -80 °C.

Las muestras de lípidos se analizaron en el Centro de Espectrometría de Masas de Harvard. Los análisis LC-MS se modificaron a partir de Miraldi81 y se realizaron en un Orbitrap Exactive plus (Thermo Scientific) en línea con un Ultimate 3000 LC (Thermo Scientific). Cada muestra se analizó en modos positivo y negativo, en los 5 principales modos MSMS automáticos dependientes de datos. El hardware de la columna consistía en una columna Biobond C4 (4,6 × 50 mm, 5 μm, Dikma Technologies). El caudal se estableció en 100 μl min-1 durante 5 min con 0% de fase móvil B (MB), luego se cambió a 400 μl min-1 durante 50 min, con un gradiente lineal de MB de 20 a 100%. Luego, la columna se lavó a 500 μl min-1 durante 8 min a 100% MB antes de reequilibrarse durante 7 min a 0% MB y 500 μl min-1. Para las ejecuciones en modo positivo, los tampones consistieron para la fase móvil A (MA) de formiato de amonio 5 mM, 0,1 % de ácido fórmico y 5 % de metanol en agua, y para la fase móvil B (MB) de formiato de amonio 5 mM, 0,1 % de ácido fórmico. 5% agua, 35% metanol en isopropanol. Para las series negativas, los tampones consistieron para MA en 0,03% de hidróxido de amonio, 5% de metanol en agua y para MB en 0,03% de hidróxido de amonio, 5% de agua y 35% de metanol en isopropanol. Los lípidos se identificaron y cuantificaron utilizando el software Lipidsearch© (versión 4.2.27, Mitsui Knowledge Industry, Universidad de Tokio). Las integraciones y la máxima calidad se seleccionaron manualmente antes de exportar y analizar los datos en Microsoft Excel.

Se cultivaron parásitos 3D7 altamente sincronizados en una placa de 24 pocillos con un hematocrito del 5% en 2 ml de medio completo durante la duración del experimento. Cada pocillo se expuso al fármaco o DMSO en el volumen más alto de fármaco utilizado (1 μM, 5 μM o 10 μM para MMV665924 y MMV019719, 100 nM, 500 nM o 1 μM para MMV897615) durante 12 h en diferentes momentos a lo largo del ciclo de vida (0–12 h, 12–24 h, 24–36 h, 36–48 h) o durante todo el ciclo de vida (0–48 h). Cada 12 h, los parásitos expuestos al fármaco se lavaron en 10 ml de medio incompleto (sin Albumax II) y se resuspendieron en medio completo sin ningún fármaco y se expuso un nuevo pocillo de parásitos al tratamiento farmacológico. La mitad del medio se eliminó y se repuso en cada momento en todos los pocillos para garantizar suficientes nutrientes para los parásitos. Se untó cada pocillo que había sido expuesto previamente y se tiñeron 5 µl con SYBR Green I para análisis de citometría de flujo. Se tomó un punto de tiempo final 65 h después de iniciar el experimento.

Los parásitos se tiñeron en SYBR Green I 10X en PBS 1X durante 30 minutos en la oscuridad a 37 °C. Se eliminó la solución de tinción y las células se resuspendieron en cinco veces el volumen del volumen inicial de PBS. La adquisición de datos de citometría de flujo se realizó en un MACSQuant VYB (Milteni Biotec) con un láser de 488 nm y un filtro de 525 nm y se analizó con FlowJo 2. Los glóbulos rojos se controlaron en la dispersión de luz delantera y lateral y se detectaron glóbulos rojos infectados en el canal B1. Se analizaron al menos 100.000 eventos por muestra. En la figura complementaria 8 se muestra un ejemplo de la estrategia de activación.

Todos los experimentos se realizaron al menos en tres réplicas biológicas, a menos que se indique lo contrario. Los valores de EC50 para las curvas de respuesta a la dosis se calcularon utilizando el ajuste de curvas de regresión no lineal en Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Las medias se compararon utilizando un ANOVA unidireccional con la prueba posterior de Dunnett cuando se compararon más de tres cepas con una línea de control y una prueba t de Student no apareada bilateral cuando solo se compararon dos cepas entre sí (Prism 7 - 9.5. 0. o Excel.16.69.1). No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra y los investigadores no estaban cegados a la identidad de la muestra.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de WGS que respaldan los hallazgos de este estudio se han depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) en EMBL-EBI con el número de acceso PRJEB57553. Todos los conjuntos de datos de TPP generados con MMV897615 se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange (https://www.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios PRIDE (https://www.ebi.ac.uk ›pride)77 con el identificador PXD034937. Todos los demás datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y su información complementaria. La base de datos PlasmoDB sirvió como referencia para la anotación y expresión de genes [https://plasmodb.org]. La distribución de SNP en todo el genoma se obtuvo del proyecto Pf3k [versión 5; www.malariagen.net/projects/pf3k]. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código utilizado para el análisis genético de poblaciones está disponible gratuitamente para su reutilización y se puede encontrar en GitHub (https://github.com/amearly/Dantzler_et_al_Diversity_Calcs; https://doi.org/10.5281/zenodo.7613429) y zenodo ( https://zenodo.org/record/7613429#.Y-GYgezML1K)71.

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Agradecemos a Marcus Lee por la amable donación del vector pDC2-cam-Cas9-U6-hDHFR y la línea Dd2polδ, y a Daniel Goldberg por la línea 3D7_IG06. Agradecemos a Terrie Taylor y Karl Seydel por la recolección y uso de los aislamientos del parásito de Malawi. También agradecemos a Michael D Barrins y Matthew Brendan Lopes Costa-Rodrigues por la extracción de muestras y la cromatografía para los experimentos de GC-FID. También nos gustaría agradecer a Didier Leroy por el desarrollo del compuesto y a MMV y Takeda Pharmaceutical Company Limited por haber proporcionado MMV897615. Financiamiento: La Fundación Bill y Melinda Gates otorga OPP1156051 a DFW y OPP1054480 a EAW. Medicamentos para la malaria Venture (MMV08/0015) y NIH (R37 AI050234) para DAF.

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SB, CFAP, RLs, PMC, KAS, VCL, SM, SD, SS, ASN, ARD, RM, NW, VC, MGGL y VF realizaron los experimentos, SB, RLS, TY, VC, VF y AME analizaron los datos. , SB, AKL, DM, JF, FJG, EAW, SKV, BL, MD, DAF, SW, JCN y DFW proporcionaron reactivos y/o concibieron y conceptualizaron los experimentos, SB, RLS, EAW, DAF, SW y DFW escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Dyann F. Wirth.

MD y BL son empleados de MMV. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Darren Creek, Koen Dechering y Colin Sutherland por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Bopp, S., Pasaje, CFA, Summers, RL et al. Los potentes inhibidores de la acil-CoA sintetasa 10 matan al Plasmodium falciparum al interrumpir la formación de triglicéridos. Nat Comuna 14, 1455 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36921-2

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Recibido: 05 de junio de 2020

Aceptado: 20 de febrero de 2023

Publicado: 16 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36921-2

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