La oxidación de ácidos grasos organiza supercomplejos mitocondriales para sostener las ROS astrocíticas y la cognición

Metabolismo de la naturaleza (2023)Citar este artículo

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Al tener acceso directo a la vasculatura cerebral, los astrocitos pueden absorber los nutrientes disponibles en la sangre y metabolizarlos para satisfacer sus propias necesidades energéticas y entregar intermediarios metabólicos a las sinapsis locales1,2. Por lo tanto, estas células gliales deberían ser metabólicamente adaptables para intercambiar diferentes sustratos. Sin embargo, los estudios in vitro e in vivo muestran consistentemente que los astrocitos son principalmente glicolíticos3,4,5,6,7, lo que sugiere que la glucosa es su principal precursor metabólico. En particular, los datos transcriptómicos8,9 y los estudios in vitro10 revelan que los astrocitos de ratón son capaces de oxidar ácidos grasos mitocondrialmente y que pueden desintoxicar el exceso de ácidos grasos derivados de neuronas en modelos de enfermedades11,12. Aún así, se desconoce la ventaja metabólica real del uso de ácidos grasos por parte de los astrocitos y su impacto fisiológico en las funciones cerebrales de orden superior. Aquí, mostramos que la eliminación de la carnitina-palmitoil transferasa-1A (CPT1A), una enzima clave de la oxidación de ácidos grasos mitocondriales, en astrocitos de ratones adultos causa deterioro cognitivo. Mecánicamente, la disminución de la oxidación de los ácidos grasos reconectó el metabolismo del piruvato astrocítico para facilitar el flujo de electrones a través de una cadena respiratoria mitocondrial súper ensamblada, lo que resultó en una atenuación de la formación de especies reactivas de oxígeno. Por lo tanto, los astrocitos metabolizan naturalmente los ácidos grasos para preservar la cadena respiratoria mitocondrial en una conformación desensamblada energéticamente ineficiente que asegura la señalización de especies reactivas de oxígeno y sostiene el rendimiento cognitivo.

Para determinar los niveles de expresión de los genes que codifican el uso de ácidos grasos en astrocitos y neuronas, realizamos una PCR cuantitativa con análisis de transcripción inversa (RT-qPCR), que reveló una mayor abundancia de ARN mensajero en la carnitina-palmitoil transferasa-1A (Cpt1a), responsable de entrada de acil-CoA de cadena larga en las mitocondrias13, y disminución de la acetil-CoA carboxilasa-1 (Acc1), responsable de la biosíntesis de la abundancia de ARNm de malonil-CoA14-inhibidor de CPT1A en astrocitos primarios de ratón en comparación con las neuronas (Figura complementaria 1a) . Además, la abundancia de ARNm de la isoforma Acc2 mitocondrial, que se encuentra altamente enriquecida en tejidos oxidativos como el músculo esquelético y el corazón15, de la acetil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (Acadl), que cataliza el paso inicial de la oxidación de los ácidos grasos mitocondriales, de Se encontró que el Cpt1c ubicado en el retículo endoplásmico y la proteína trifuncional mitocondrial α (Mtpα), que es funcionalmente responsable de la transferencia de electrones desde los ácidos grasos de cadena larga mitocondriales a los complejos respiratorios mitocondriales I (CI) y III (CIII)16, eran más altos en astrocitos versus neuronas (Figura complementaria 1a). Aunque estos son valores relativos, son coherentes con observaciones previas8,9,10 que sugieren que los astrocitos están mejor equipados que las neuronas para oxidar mitocondrialmente ácidos grasos de cadena larga. Para sustentar funcionalmente esta afirmación, se analizó la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en astrocitos y neuronas utilizando la tecnología Seahorse en medio a base de glucosa en ausencia o presencia de etomoxir: un inhibidor potente e irreversible de CPT1 (ref. 17). Como se muestra en la figura complementaria 1b, se encontró que la respiración mitocondrial basal era aproximadamente 1,7 veces mayor en las neuronas en comparación con los astrocitos, lo que confirma hallazgos anteriores18. En particular, la proporción de inhibición de la OCR mitocondrial por etomoxir fue de aproximadamente el 20% en las neuronas y aproximadamente el 35% en los astrocitos (Figura complementaria 1b), lo que indica que los ácidos grasos son sustratos respiratorios mitocondriales preferidos para los astrocitos que para las neuronas. Aproximadamente el 62% de la respiración mitocondrial astrocítica ligada a ATP fue sostenida por ácidos grasos (Figura complementaria 1b).

Para investigar la ventaja metabólica de la oxidación de ácidos grasos mitocondriales en astrocitos in vivo y, de lo contrario, superar los posibles inconvenientes de los inhibidores farmacológicos, diseñamos genéticamente un modelo de ratón knockout (KO) de Cpt1a específico de astrocitos. Para ello, a ratones Cpt1alox/lox19 de 2 meses de edad se les inyectaron por vía intravenosa, a través del seno retroorbitario20, partículas de virus adenoasociado (AAV) del serotipo PHP.eB que expresaban la recombinasa Cre gobernada por el ácido glial-fibrilar específico de los astrocitos. promotor corto de proteína (GFAP) (PHP.eB-AAV-gfaABC1D-Cre-GFP) (Fig. 1a). Este tratamiento fue eficiente, a juzgar por la amplia expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en todo el cerebro (Figura complementaria 1c). Los controles (tipo salvaje, WT) fueron ratones Cpt1alox/lox que recibieron dosis equivalentes de las mismas partículas de virus, excepto que carecían de Cre recombinasa, y todos los ratones se analizaron después de 1 a 9 meses (Fig. 1a). Como se muestra en la Fig. 1b (Fig. 1d complementaria), el tratamiento con PHP.eB-AAV-gfaABC1D-Cre-GFP causó una reducción significativa en la abundancia de la proteína CPT1A en el cerebro. Dado que el cerebro contiene otros tipos de células además de los astrocitos, también analizamos la abundancia de CPT1A en astrocitos ex vivo aislados inmunomagnéticamente del cerebro de los ratones adultos CPT1A KO (Fig. 1a), lo que reveló la abolición de CPT1A específicamente en los astrocitos positivos (ACSA+). fracción, pero no en la fracción de astrocitos negativos (ACSA-) (Fig. 1c). Para determinar la eficacia funcional de CPT1A KO, se incubaron cortes de cerebro recién aislados ex vivo de ratones adultos con ácido palmítico [U-14C] para evaluar la tasa de producción de 14CO2 como índice del flujo de oxidación de ácidos grasos. Como se muestra en la Fig. 1d, el flujo de oxidación en el cerebro se redujo significativamente en aproximadamente un 75% en CPT1A KO en comparación con los ratones WT. Para explicar si la pérdida de CPT1A astrocítica alteró otras vías del metabolismo cerebral, realizamos metabolómica no dirigida en muestras de cerebro. Como se muestra en el gráfico del volcán (Figura 1e complementaria) y en el mapa de calor (Figura 1f complementaria), encontramos que 17 metabolitos disminuyeron significativamente y 43 metabolitos aumentaron significativamente en el cerebro de los ratones CPT1A KO específicos de astrocitos. Los resultados revelaron una mayor abundancia de ácidos grasos de cadena larga y derivados de acilcarnitina de cadena larga, y una menor abundancia de ácidos grasos de cadena corta (Fig. 1e), lo que sugiere una disminución del uso de ácidos grasos de cadena larga y un aumento de los de cadena corta. En particular, la concentración de piruvato disminuyó significativamente en aproximadamente un 26% en el cerebro de ratones CPT1A KO específicos de astrocitos (Fig. 1e), lo que sugiere una alteración en el metabolismo de este producto intermedio glicolítico.

a, Estrategia utilizada para generar ratones Cpt1a KO específicos de astrocitos y para purificar inmunomagnéticamente los astrocitos CPT1A KO del cerebro adulto. Creado con BioRender.com. b, Western blot contra la proteína CPT1A en cerebro Cpt1a KO específico de astrocitos. Se utilizó β-tubulina como control de carga; n = 2 ratones por condición (Figura complementaria 1d). c, transferencia Western contra la proteína CPT1A en células ACSA+ (astrocitos) y ACSA- (no astrocitos), aisladas inmunomagnéticamente de cerebro de ratón Cpt1a KO específico de astrocitos; n = 2 ratones por condición. Se utilizó GFAP como control de carga y enriquecimiento de astrocitos. d, Tasa de producción de 14CO2 a partir de ácido palmítico [U-14C] en cortes de cerebro de ratones WT y Cpt1a KO específicos de astrocitos. Los datos son media ± sem Se indica el valor P (n = 3 muestras biológicamente independientes; prueba t de Student no apareada, bilateral). e, Concentraciones de una selección de metabolitos alteradas en el estudio metabolómico de las muestras de cerebro de Cpt1a KO específico de astrocitos en comparación con ratones WT. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 6 ratones por condición; prueba t de Student no apareada, bilateral). au, unidades arbitrarias.

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A continuación, nuestro objetivo fue caracterizar metabólicamente más a fondo los astrocitos CPT1A KO. Para hacerlo, se transdujeron astrocitos en cultivo primario de ratones Cpt1alox/lox con adenovirus que expresaban Cre recombinasa bajo el potente promotor de citomegalovirus (CMV) (AdV-CMV-Cre-GFP) (Fig. 2a). Los astrocitos Cpt1alox/lox transducidos con AdV que carece de recombinasa Cre (AdV-CMV-GFP) se utilizaron como controles (WT). El análisis RT-qPCR reveló que los ARNm de Cpt1a, no Cpt1b o Cpt1c, disminuyen en los astrocitos transducidos con AdV-CMV-Cre-GFP (Figura complementaria 2a). Como se muestra en la Fig. 2b (Fig. 2a complementaria), la proteína CPT1A se eliminó eficientemente en los astrocitos transducidos con AdV-CMV-Cre-GFP en comparación con las células WT. Las abundancias de proteínas CPT1B, CPT1C y CPT2 no se vieron afectadas (Figura complementaria 2c). La liberación de 3-hidroxibutirato de los astrocitos transducidos con AdV-CMV-Cre-GFP se redujo significativamente, lo que sugiere una cetogénesis alterada en los astrocitos CPT1A KO (Figura complementaria 2d). Además, evaluamos la tasa de conversión del ácido palmítico [1-14C] a 14CO2 y a 14C-cetonas, que se redujeron en aproximadamente un 50% en CPT1A KO en comparación con los astrocitos WT (Fig. 2c, d y Fig. complementaria 2e). El etomoxir, que inhibe la absorción de ácidos grasos mediada por CPT1 (mitocondrial) y carnitina octanoiltransferasa (peroxisomal), prácticamente eliminó la oxidación del ácido palmítico [U-14C] (Figura complementaria 2f). Por lo tanto, la cooperación de un compartimento celular, probablemente el peroxisoma22, que no depende de CPT1A, al convertir ácidos grasos de cadena larga en cadena corta, probablemente contribuya a la oxidación mitocondrial de los ácidos grasos. Dado que se cree que el metabolismo energético de los astrocitos se sustenta en gran medida mediante la glucólisis3,4,5, nuestro siguiente objetivo fue evaluar el impacto de la oxidación de los ácidos grasos en el metabolismo de la glucosa. Para hacer esto, primero analizamos la tasa de oxidación de la glucosa [6-14C] a 14CO2, un proceso que tiene lugar en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Como se muestra en la Fig. 2e, la descarboxilación de la glucosa [6-14C] aumentó en los astrocitos CPT1A KO. La glucosa 14C6 a través de la glucólisis marca el piruvato 14C3, que se descarboxila exclusivamente en el ciclo del TCA dependiendo de las tasas de glucólisis, la importación de piruvato mitocondrial y la actividad de la piruvato deshidrogenasa (PDH). Para identificar cuál de estos pasos explica el aumento de la tasa de descarboxilación de [6-14C]glucosa, evaluamos la descarboxilación de [1-14C]piruvato, que tiene lugar exclusivamente en PDH, después de la importación de piruvato mitocondrial. Encontramos un aumento significativo en la formación de 14CO2 a partir de piruvato [1-14C] en los astrocitos CPT1 KO (Fig. 2f), lo que indica una mayor tasa de descarboxilación de PDH. Esto fue validado mediante la evaluación del estado de fosforilación de 293Ser de la subunidad PDH A1 (PDHA1), que se redujo (Figura complementaria 2g), lo que indica activación de PDH, un extremo que fue confirmado por la actividad específica de PDH (Figura complementaria 2h). Este resultado, que explica la reducción observada en la concentración de piruvato en el análisis metabolómico (Fig. 1e), indica que, ante la pérdida de Cpt1a, los astrocitos experimentan un recableado metabólico que consiste en una mayor descarboxilación del piruvato a acetil-coenzima A. El lactato es el principal destino metabólico. de piruvato derivado glicolíticamente en astrocitos3,4,5. Por lo tanto, evaluamos si la descarboxilación mejorada del piruvato mitocondrial alteró el lactato liberado por los astrocitos. Como se muestra en la Fig. 2g, la formación de lactato se redujo en una proporción (aproximadamente 118 nmol h-1 mg de proteína-1) consistente con un aumento de la descarboxilación de piruvato (aproximadamente 65 nmol h-1 mg de proteína-1) (Fig. 2f) en Astrocitos CPT1A KO, un efecto que no puede explicarse por cambios en el flujo de glucólisis, medido específicamente por la tasa de conversión de [3-3H] glucosa en 3H2O (Fig. 2h). Estos resultados indican que, en Cpt1a KO, los astrocitos reconfiguran el destino metabólico del piruvato para aumentar su oxidación mitocondrial sin afectar la glucólisis. Por tanto, la glucólisis y la β-oxidación parecen ser vías reguladas de forma independiente destinadas a mantener diferentes facetas del metabolismo de los astrocitos.

a, Estrategia utilizada para obtener astrocitos Cpt1a KO en astrocitos en cultivo primario. Creado con BioRender.com. b, Western blot contra la proteína CPT1A en astrocitos Cpt1a KO en cultivo primario 5 días después de la transducción de AdV-CMV-Cre-GFP; n = 3 preparaciones de cultivos celulares biológicamente independientes; Prueba t de Student no apareada, de dos colas. Se utilizó β-actina como control de carga (Figura complementaria 2b). c, producción de 14CO2 a partir de ácido palmítico [1-14C] en astrocitos WT y Cpt1a KO en cultivo primario. Los datos son media ± sem Se indica el valor P (n = 4 muestras biológicamente independientes; prueba t de Student no apareada, bilateral). d, Producción de 14cetonas a partir de ácido palmítico [1-14C] en astrocitos WT y Cpt1a KO en cultivo primario. Los datos son media ± sem Se indica el valor P (n = 4 muestras biológicamente independientes; prueba t de Student no apareada, bilateral). e–h, producción de 14CO2 a partir de glucosa [6-14C] (e) o ácido pirúvico [1-14C] (f), tasa de lactato liberado (g) y flujo glucolítico medido por la tasa de glucosa [3-3H] conversión en 3H2O (h), en astrocitos WT y Cpt1a KO en cultivo primario. TPI: triosafosfato isomerasa. Los datos son media ± sem Se indican los valores P; n = 6 (e), 6 (f), 8 (g) y 6 (h) preparaciones de cultivos celulares biológicamente independientes; Prueba t de Student pareada, bilateral. i, análisis de OCR y parámetros calculados en astrocitos WT y Cpt1a KO en cultivo primario. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 5 preparaciones de cultivos celulares biológicamente independientes; prueba t de Student no apareada, bilateral) (Figura complementaria 2j, k).

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Dada la contribución de la oxidación de ácidos grasos en el mantenimiento de la respiración mitocondrial astrocítica (Figura complementaria 1b), a continuación analizamos el OCR en los astrocitos CPT1A KO. Como se muestra en la Fig. 2i, la pérdida de CPT1A aumentó aproximadamente 1,5 veces la respiración mitocondrial basal y ligada a ATP, sin afectar estadísticamente de manera significativa la respiración máxima y no mitocondrial. Estos resultados aparentemente contrastan con los que muestran una disminución de la respiración mitocondrial basal por etomoxir (Figura complementaria 1b). Sin embargo, etomoxir inhibe agudamente CPT1, mientras que la deficiencia genética de Cpt1a permite que los astrocitos se adapten a la pérdida de CPT1A. Por tanto, la falta de CPT1A parece reprogramar el metabolismo astrocítico a una conformación mediante la cual mejora la respiración mitocondrial. Tal mejora no es consecuencia de un aumento de la masa mitocondrial, según los parámetros de abundancia de proteínas (Figura complementaria 2i). Dado que el flujo de electrones a través del CI mitocondrial es el curso energéticamente más eficiente para conservar la energía mitocondrial, analizamos la proporción de respiración mitocondrial que contribuye este complejo. Para hacer esto, inhibimos la respiración mitocondrial con rotenona, un inhibidor específico de CI, tanto en células intactas (Figura complementaria 2j) como en células permeabilizadas con digitonina en presencia de sustratos de CI y ADP (Figura complementaria 2k), lo que reveló que el La contribución de CI para sostener la respiración mitocondrial aumentó significativamente en los astrocitos CPT1A KO versus WT. En conjunto, estos datos indican que la oxidación mitocondrial de los ácidos grasos endógenos en los astrocitos preserva la conformación de la cadena respiratoria mitocondrial en un modo energéticamente menos activo.

Para comprender el mecanismo molecular por el cual la oxidación de los ácidos grasos mantiene la respiración mitocondrial menos activa en los astrocitos, intentamos investigar el superambligo de los complejos respiratorios, que se cree que regulan la respiración mitocondrial24,25,26. Para hacerlo, se aislaron mitocondrias de astrocitos CPT1A KO y WT y sus proteínas se sometieron a electroforesis en gel nativo azul (BNGE) seguida de transferencia Western contra las subunidades CI, CIII y CIV. El análisis reveló que la pérdida de CPT1A promovió un aumento significativo en la formación de supercomplejos mitocondriales (SC) (Fig. 3a, b y Fig. 3a complementaria), lo que probablemente explica el aumento observado en la respiración sostenida con CI (Fig. 2j, k complementaria). El aumento de la formación de SC y la respiración sostenida por CI no se puede atribuir a una supuesta mejora en la abundancia de proteínas de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial (Figura complementaria 3b) ni a una mejora en la actividad específica de CI (Figura complementaria 3c). Las actividades específicas de CI – III y CIV aumentaron significativamente en los astrocitos CPT1A KO (Fig. 3c complementaria), en coherencia con la respiración mitocondrial mejorada (Fig. 2i) y la formación de SC (Fig. 3a, b y Fig. 3a complementaria). Aunque es tema de debate25,26, además de la regulación de la respiración, se ha sugerido que el superensamblaje de CI en SC regula la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células del corazón27 y del cerebro, incluidas las neuronas y los astrocitos18. En consecuencia, a continuación investigamos si el superconjunto observado de la cadena respiratoria mitocondrial en los astrocitos CPT1A KO tenía un impacto en la abundancia de ROS. Como se muestra en la Fig. 3c, el peróxido de hidrógeno (H2O2) fue significativamente menor en los astrocitos CPT1A KO. Para establecer un vínculo causal entre el aumento de la formación de SC y la disminución de la generación de H2O2 en los astrocitos CPT1A KO, eliminamos la subunidad de CI NDUFS1 (Figura complementaria 3d), una estrategia utilizada anteriormente para reducir los niveles de CI. Este tratamiento provocó el desmontaje de SC que contiene CI en los astrocitos (Fig. 3e complementaria), evitó el aumento de la respiración basal mitocondrial (Fig. 3e) sin afectar estadísticamente de manera significativa la respiración máxima, ligada a ATP y no mitocondrial (Fig. 3f complementaria) y aumento de H2O2 en los astrocitos CPT1A KO (Fig. 3f). Si bien se requeriría un trabajo estructural de mayor resolución para confirmar este mecanismo25, en conjunto, estos datos indican que la oxidación de ácidos grasos mantiene la cadena respiratoria mitocondrial astrocítica bajo una conformación estructural energéticamente menos favorable que es capaz de sostener la generación de ROS.

a, SC libres y que contienen CI (SC-CI) en astrocitos primarios WT y Cpt1a KO, analizados por BNGE seguido de inmunotransferencia contra la subunidad NDUFA9 de CI. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 3 preparaciones de cultivos celulares biológicamente independientes; prueba t de Student no apareada, bilateral). b, SC libres que contienen CIII y CIII (SC-CIII) en astrocitos primarios WT y Cpt1a KO, analizados por BNGE seguido de inmunotransferencia contra la subunidad UQCRC2 de CIII. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 3 preparaciones de cultivos celulares biológicamente independientes; prueba t de Student no apareada, bilateral). c, producción de H2O2 en astrocitos WT y CPT1A KO en cultivo primario. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 6 preparaciones de cultivos celulares independientes; prueba t de Student no apareada, bilateral). d, análisis de OCR en astrocitos WT y Cpt1a KO en cultivo primario, ya sea transfectados con ARNip codificados (control) o NDUFS1. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 4 preparaciones de cultivo celular biológicamente independientes) (Figura complementaria 3f). e, Respiración basal en astrocitos WT y CPT1A KO en cultivo primario, ya sea transfectados con ARNip codificados (control) o NDUFS1. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 4 preparaciones de cultivos celulares biológicamente independientes; ANOVA de dos vías seguido de Tukey). f, producción de H2O2 por astrocitos WT y CPTA1A KO en cultivo primario, ya sea transfectados con ARNip codificados (control) o NDUFS1. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 3 preparaciones de cultivos celulares biológicamente independientes; prueba t de Student no apareada múltiple). g, Estrategia utilizada para evaluar el efecto de los astrocitos Cpt1a KO en las neuronas WT o mCAT en cultivo primario. Creado con BioRender.com. h – l, concentración de glutatión (h), ROS mitocondrial (i), ∆ψm (j), apoptosis (k) y abundancias de ARNm de c-Fos y Arc (l) en neuronas transgénicas que expresan WT o mCAT después del cocultivo con WT o Astrocitos Cpt1a KO; n = 3 (h), 4 (i), 4 (j), 4 (k, WT), 4 (k, mitoCAT) y 4 (l) preparaciones de cultivos celulares biológicamente independientes; Prueba t de Student pareada, bilateral para comparaciones simples y ANOVA bidireccional seguida de Tukey para comparaciones múltiples.

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Los astrocitos ROS constituyen señales redox que modulan el metabolismo cerebral para mantener el comportamiento del ratón28. Además, los astrocitos son capaces de transformar ácidos grasos en cuerpos cetónicos10,29,30 (Fig. 2d y Fig. 2d complementaria) que, según estudios realizados en Drosophila, pueden transportarse a las neuronas para uso oxidativo31,32. Además, aquí mostramos que, siempre que los astrocitos oxiden los ácidos grasos, el piruvato se convierte en lactato, un metabolito que también puede transportarse a las neuronas33,34. Dado que la eliminación de Cpt1a en los astrocitos perjudicó la generación de ROS, que mantiene fisiológicamente la integridad neuronal y la cognición del ratón, a continuación investigamos su impacto en la función y el comportamiento neuronal. Las neuronas cocultivadas con astrocitos CPT1A KO (Fig. 3g) sufrieron una pérdida de glutatión antioxidante (Fig. 3h), en consonancia con observaciones previas28, lo que sugiere estrés redox neuronal. De hecho, estas neuronas mostraron un aumento de ROS mitocondrial (Fig. 3i), alteración del potencial de membrana mitocondrial (∆ψm) (Fig. 3j) y muerte apoptótica (Fig. 3k). Las neuronas que expresan una isoforma mitocondrial de la enzima antioxidante catalasa (neuronas de catalasa mitocondrial (mCAT), que previnieron eficientemente el aumento de ROS mitocondrial causado por la coincubación con astrocitos CPT1A (Fig. 3i), abolieron la pérdida de ∆ψm y la apoptosis (Fig. 3j, k ). Estas alteraciones bioenergéticas causaron disfunción neuronal, a juzgar por la reducción de la abundancia de ARNm de los marcadores funcionales neuronales35,36 c-Fos y Arc de una manera mitocondrial dependiente de ROS (Fig. 3l). Para determinar el impacto in vivo de nuestros hallazgos, aislamos inmunomagnéticamente astrocitos de ratones WT y Cpt1a KO específicos de astrocitos (Fig. 4a). La caracterización de los marcadores de células neurales confirmó la pureza de la fracción ACSA+ (astrocitos) en ambos genotipos (Figura complementaria 4a). El análisis de la cadena respiratoria mitocondrial SC en las fracciones mitocondriales de estas células reveló que la pérdida de CPT1A aumentó la formación de SC, un efecto que se observó tanto en ratones machos como hembras (Figura complementaria 4b). El aislamiento inmunomagnético de neuronas de ratones Cpt1a KO específicos de astrocitos (Fig. 4a), que resultó en una fracción enriquecida (Neuron+) de acuerdo con los marcadores de células neurales (Fig. 4a complementaria), seguido del análisis SC de sus fracciones mitocondriales, reveló CI desmontaje de SC tanto en ratones machos como hembras (Figura complementaria 4c). Estos resultados indican que la pérdida de CPT1A en los astrocitos provoca disfunción mitocondrial en las neuronas vecinas. En buena concordancia con los datos obtenidos en astrocitos cultivados primarios, los astrocitos aislados de ratones adultos Cpt1a KO específicos de astrocitos mostraron un aumento de la respiración basal y ligada a ATP (Fig. 4b y Fig. Suplementaria 4d), disminución de H2O2 y ROS mitocondrial (Fig. 4c ) con ∆ψm sin cambios (Fig. 4e complementaria) en comparación con los aislados de ratones WT. Las neuronas aisladas de ratones adultos Cpt1a KO específicos de astrocitos mostraron una disminución de la respiración basal y ligada a ATP (Fig. 4b y Fig. 4d complementaria), aumento de H2O2 y ROS mitocondrial (Fig. 4c) con ∆ψm reducido (Fig. 4e complementaria) cuando en comparación con los aislados de ratones WT. Por lo tanto, las neuronas adyacentes a los astrocitos CPT1A KO desarrollan cambios adaptativos que resultan en disfunción mitocondrial y estrés redox. Para evaluar si los efectos observados en las neuronas tienen implicaciones conductuales, se sometió a ratones a una batería de pruebas de rendimiento. Los resultados revelaron que los ratones Cpt1a KO específicos de astrocitos no desarrollaron un deterioro significativo en el rendimiento en campo abierto (Figura complementaria 5a) o en la prueba de rotarod (Figura complementaria 5b), lo que indica falta de ansiedad y coordinación motora. Sin embargo, los ratones Cpt1a KO específicos de astrocitos mostraron un deterioro en la memoria de trabajo, a juzgar por la disminución del índice de discriminación observado en la nueva prueba de reconocimiento de objetos (Fig. 4d y Fig. Suplementaria 5c), así como un deterioro en la memoria de trabajo a largo plazo. término memoria espacial según la prueba del laberinto de Barnes (Fig. 4e y Fig. complementaria 5d). Aunque a través de un mecanismo diferente, se produce un resultado similar en la ablación genética de la isoforma Cpt1c específica de la neurona37. En conjunto, estos resultados indican que la oxidación de ácidos grasos en los astrocitos es esencial para mantener la formación de ROS mitocondrial, la aptitud energética neuronal y el rendimiento cognitivo en ratones.

a, Estrategia utilizada para aislar inmunomagnéticamente astrocitos y neuronas de ratones adultos WT o CPT1A KO específicos de astrocitos. Creado con BioRender.com. b, análisis de OCR y respiración basal calculada en astrocitos (arriba) y neuronas (abajo) aislados inmunomagnéticamente de ratones WT y Cpt1a KO específicos de astrocitos. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 4 ratones por genotipo; prueba t de Student no apareada, bilateral). c, análisis de H2O2 y ROS mitocondrial en astrocitos (arriba) y neuronas (abajo) aislados inmunomagnéticamente de ratones WT y Cpt1a KO específicos de astrocitos. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 5 ratones por genotipo; prueba t de Student no apareada, bilateral). d, Prueba de reconocimiento de objetos novedosos en ratones WT y Cpt1a KO específicos de astrocitos. Se muestran rutas representativas y mapas de calor cuantitativos espaciotemporales. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 9 (WT) o 7 (CPT1A KO) ratones; prueba t de Student no apareada, bilateral). e, prueba del laberinto de Barnes en ratones WT y Cpt1a KO específicos de astrocitos 8 días después del entrenamiento. Se muestran mapas de calor cuantitativos espaciotemporales. Los datos son media ± sem Se indican los valores de P (n = 9 (WT) o 7 (CPT1A KO) ratones; ANOVA de dos vías seguido de Tukey). Valores de P en la figura.

Datos fuente

En conclusión, aquí describimos que la oxidación mitocondrial de ácidos grasos en astrocitos exhibe señalización y ventajas cerebrales de orden superior. Esto está respaldado principalmente por los hallazgos de que la eliminación genética específica de los astrocitos de un paso clave en el uso de ácidos grasos, CPT1A, altera la producción fisiológica de señalización de ROS mitocondrial. A diferencia del catabolismo de la glucosa que, a través de la oxidación del piruvato, conserva principalmente equivalentes reductores como NADH(H+), la β-oxidación de ácidos grasos conserva tanto NADH(H+) como FADH2. En particular, en los astrocitos, la mayor parte de la acetil-coenzima A derivada de ácidos grasos se convierte en cuerpos cetónicos10 en lugar del ciclo de TCA que genera NADH(H+), fortaleciendo así la contribución relativa del FADH2 derivado de ácidos grasos al flujo de electrones a CIII a través de la transferencia de electrones. -ubiquinona oxidorreductasa. De acuerdo con esto, la expresión relativa de ARNm de Acadl y Mtpα, responsable de la transferencia de electrones de ácidos grasos de cadena larga a CIII (ref. 16), es alta en los astrocitos. Por el contrario, el deterioro de la oxidación de ácidos grasos por la pérdida de CPT1A adapta el metabolismo de los astrocitos hacia una mayor oxidación mitocondrial de piruvato, el ensamblaje de CI en SC y la respiración mitocondrial. Este mecanismo es coherente con el modelo recientemente propuesto23 de que la actividad de la PDH converge con la organización funcional de la cadena respiratoria mitocondrial para garantizar adaptaciones metabólicas óptimas. Nuestros datos también confirman18 que la cadena respiratoria mitocondrial está organizada en los astrocitos bajo una conformación en la que el CI no está completamente ensamblado en SC, lo que permite que los ácidos grasos contribuyan a la respiración mitocondrial a través de la ubiquinona oxidorreductasa transportadora de electrones. Aunque se sabe que esta vía es menos eficiente energéticamente que la respiración impulsada por CI, permite una generación relativamente alta de ROS18 con fines de señalización28. Al otorgar el uso preferencial de ácidos grasos, nuestros resultados indican que los astrocitos priorizan la generación de ROS mitocondriales, esenciales para mantener el rendimiento cognitivo28, sobre un beneficio bioenergético (Figura complementaria 5e). Se cree que los astrocitos satisfacen en gran medida sus necesidades energéticas a partir de la glucólisis3,7,38,39,40,41, una vía que aquí mostramos coexiste con la oxidación de ácidos grasos. Sin embargo, a la luz de nuestros datos, la contribución de estas dos vías a la bioenergética y las funciones de señalización no es análoga. Por lo tanto, aunque los ácidos grasos se oxidan a través del ciclo del TCA a un ritmo mayor que la glucosa en los astrocitos, los ácidos grasos muestran una mayor respiración relacionada con la producción de ATP, lo que indica que se requiere más combustible para la homeostasis energética. Por lo tanto, la glucólisis y la oxidación de ácidos grasos parecen ser dos vías que sustentan facetas esenciales del metabolismo de los astrocitos y la señalización de ROS.

Todos los protocolos se realizaron según la Directiva de la Unión Europea 86/609/CEE y la Recomendación 2007/526/CE, sobre la protección de animales utilizados con fines experimentales y otros fines científicos, recogida en la legislación española según la ley 6/2013. Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Salamanca o CIC bioGUNE (tomografía por emisión de positrones y espectroscopia de resonancia magnética) de acuerdo con la legislación española (RD53/2013). Se generaron ratones Cpt1alox/lox introduciendo dos sitios loxP que flanquean un segmento que comprende los exones 11 y 12 del gen Cpt1a mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias bajo un fondo C57BL/6J19. Los animales fueron criados en el Centro de Experimentación Animal de la Universidad de Salamanca en jaulas (máximo cinco animales por jaula) con un ciclo de luz y oscuridad de 12 h (luz a partir de las 08:00). La humedad era del 45 al 65% y la temperatura de 20 a 25 °C. Los animales fueron alimentados ad libitum con una dieta sólida (20% proteínas, 45% lípidos y 35% carbohidratos, además de minerales y vitaminas) y agua.

Esto se llevó a cabo utilizando una estrategia AAV validada20. Esencialmente, las partículas de AAV de la cápside PHP.eB (serotipo), conocida por transducir eficientemente el sistema nervioso central mediante inyección intravenosa42, expresan la recombinasa Cre impulsada por el promotor GFAP corto específico de los astrocitos (PHP.eB-AAV-gfaABC1D-Cre-GFP ) se administraron por vía intravenosa (alícuotas de 50 µl de una solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Pluronic F-68 al 0,001 %, Sigma-Aldrich y 1 × 1011 genomas virales, VG) a través del seno retroorbitario a bebés de 2 meses. Ratones macho Cpt1alox/lox bajo una breve anestesia con sevoflurano (Sevorane, al 6% para el inicio seguido de aproximadamente el 3% para el mantenimiento en el aire con suplementos de O2 y NO2 0,4 y 0,8 l min-1, respectivamente, usando una columna de distribución de gas, Hersill H-3 y un vaporizador, InterMed Penlons Sigma Delta). Utilizamos la vía intravenosa del seno retroorbitario debido a la mayor tasa de éxito observada en comparación con la cola o la temporal43. Los hermanos de ratones WT recibieron cantidades equivalentes de las mismas partículas de AAV que no albergaban Cre recombinasa. Se utilizaron ratones a partir de 4 semanas después de las inyecciones de AAV.

Los astrocitos en cultivo primario se obtuvieron de la corteza de recién nacidos de ratones Cpt1alox/lox de 0 a 24 h de edad28. Se sembraron suspensiones celulares en matraces de plástico de 175 cm2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) bajo en glucosa (5,5 mM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y glutamina 4 mM, y se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía CO2 al 5%. . Para separar las células no astrocíticas, después de 7 días in vitro (DIV), los matraces se agitaron a 150 rpm durante la noche. Se descartó el sobrenadante y las células adheridas enriquecidas con astrocitos se volvieron a sembrar a razón de 0,8 a 1 x 105 células por cm2 en las placas apropiadas. Las células se utilizaron a 9 DIV. Se prepararon cultivos primarios individuales de neuronas corticales de ratón a partir de ratones mCAT28 o WT de 14,5 días de edad, sembrados a 2,0 x 105 células por cm2 en placas de seis pocillos o Seahorse recubiertas con poli-d-lisina (10 μg ml-1). y se incubaron en Neurobasal A suplementado con glutamina 2 mM, glucosa 5,5 mM, piruvato 0,22 mM y suplemento de antioxidante B27 al 2%. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2. A las 72 h después del recubrimiento, el medio se reemplazó por un 2% del suplemento B27 menos antioxidante (es decir, carente de vitamina E, acetato de vitamina E, superóxido dismutasa, catalasa y glutatión). Las neuronas se utilizaron el día 6. Para obtener cocultivos de astrocitos y neuronas, se volvieron a sembrar astrocitos a 8 DIV en insertos de membrana Transwell de poliéster semipermeable (4,5 cm2, tamaño de poro de 0,4 µm; Corning) y se dejaron adherir durante 24 h. Después de este tiempo, se transdujeron los astrocitos con las partículas adenovirales y, después de 4 días, se colocaron insertos que contenían astrocitos sobre 3 neuronas DIV y se cocultivaron en Neurobasal A suplementado con glutamina 2 mM, glucosa 5,5 mM, piruvato 0,22 mM y B27 al 2 %. Suplemento antioxidante durante 3 días. Inmunocitoquímica frente a oligodendrocitos neuronales (β-tubulina III: 1/300; T2200; Sigma), astrocíticos (GFAP: 1/800; AB5541; Millipore) (O4; 1/300; procedente de hibridoma de ratón amablemente donado por I. Fariñas). laboratorio) y marcador microglial (CD45; 1/200; 553076; BD) para determinar la pureza de los cultivos, que fue aproximadamente 100 % de astrocitos (para cultivos enriquecidos con astrocitos) y 99,02 % de neuronas, 0,43 % de astrocitos, 0,11 % oligodendrocitos, 0,13% de microglía y 0,31% de otras células (para cultivos enriquecidos con neuronas).

Esto se llevó a cabo mediante la transducción de 9 astrocitos primarios DIV, obtenidos de ratones Cpt1alox/lox, con partículas adenovirales que albergan recombinasa Cre impulsada por el ubicuo promotor del citomegalovirus (CMV) (AdV-CMV-Cre-GFP). Se utilizaron como astrocitos WT astrocitos de los mismos cultivos transducidos con cantidades equivalentes del mismo AdV que carece de recombinasa Cre (Ad V-CMV-GFP). Las células se utilizaron 5 días después de la transducción.

Para el genotipado de Cpt1alox/lox, se realizó una PCR con los siguientes cebadores 5′-CAGCTGCTCCACACCAAGGCT-3′ (adelante) y 5′-TGCCCTTCTACTGTCACATGG-3′ (inverso), lo que resultó en una banda de 403 pares de bases (pb) para ratones Cpt1lox/lox y 209 pb para WT19. Las condiciones de la PCR fueron 30 s a 98 °C, 30 ciclos de 5 s a 98 °C, 5 s a 60 °C, 10 s a 72 °C y una extensión final de 2 min a 72 °C. Los cebadores para genotipificar el alelo mCAT fueron 5′-CTCCCAAAGTCGCTCTGAGTTGTTATCA-3', 5′-CGATTTGTGTGTGTATGTAACTAATCTGTCTGG-3' y 5′-GCAGTGAGAAGAGTACCACCATGAGTCC-3', que produjeron una banda de 778 pb para el alelo WT y una banda de 245 pb para el Alelo mCAT. Las condiciones de PCR para el genotipado mCAT fueron 5 min a 94 °C, 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 65 °C, 3 min a 68 °C y 8 ​​min a 68 °C. Los productos de la PCR se resolvieron en gel de agarosa al 3% utilizando la escalera de ADN plus de 1 kilobase (Thermo Fisher Scientific).

Esto se realizó en muestras de ARN total, purificadas a partir de cultivos primarios de astrocitos y neuronas utilizando el kit GenElute Mammalian Total RNA Miniprep (Sigma), siguiendo el protocolo del fabricante. Las amplificaciones se realizaron en 100 ng de ARN, utilizando el kit Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step (Applied Biosystems). Los cebadores fueron (directo e inverso, respectivamente) 5′-GGATGGCTATGGTCAAGGTC-3 'y 5′-GGCCTCACAGACTCCAGGTA-3' para Cpt1a; 5′-TGCTCCATGGCAACTGCTAT-3 ′ y 5′-ACTCCCAGAGGTGCCCAAT-3 ′ para Cpt1b; 5′-CGCCCAGTATGAGAGGATGT-3 ′ y 5′-CCCTACACGGAAGAATCTGC-3 ′ para Cpt1c; 5′-GCAGTGGTCTTCGAGTGGAT-3 ′ y 5′-CAGCTGCCTTCAGACCATCA-3 ′ para Acc1; 5′-GAGTGGAAGCGGTCTCACAG-3 ′ y 5′-GCAAGCCTTCGTCCACATCC-3 ′ para Acc2; 5′-TCATTGCCAAGGCGGTTGAT-3 ′ y 5′-GCCATGGACTCAGTCACATAC-3 ′ para Acadl; 5′-CATGCGAATCCTCCAGGAAG-3' y 5′-GCTACATCCACAACCCACTTC-3' para Mtpα; 5′-GGGAATGGTGAAGACCGTGT-3 ′ y 5′-CCGTTCCCTTCGGATTCTCC-3 ′ para c-Fos; 5′-CACTCTCCCGTGAAGCCATT-3 ′ y 5-TCCTCCTCAGCGTCCACATA-3 ′ para Arc y 5′-AGAGTCATGAGCTGCCTGAC-3 ′ y 5′-CAACGTCACACTTCATGATG-3 ′ para β-actina. La abundancia de ARNm de cada transcripción se normalizó con respecto a la de β-actina obtenida en la misma muestra. Los valores normalizados resultantes en los astrocitos se expresaron como el cambio en comparación con los valores normalizados correspondientes en las neuronas. Cuando se comparó CPT1A KO con astrocitos WT, los valores normalizados resultantes en CPT1A KO se expresaron como el cambio en comparación con los valores normalizados correspondientes en astrocitos WT.

El cerebro adulto de ratón (menos el cerebelo y el bulbo olfatorio) se disocia utilizando el kit de disociación de cerebro de ratón adulto (Miltenyi Biotec). El tejido, una vez limpio, se fragmentó con un bisturí estéril en 2 ml por hemisferio de una solución de desintegración (Solución Salina Equilibrada de Earle, EBSS, NaCl 116 mM, KCl 5,4 mM, MgSO4 1,5 mM, NaHCO3 26 mM, NaH2PO4·2H2O 1,01 mM). , glucosa 4 mM, rojo fenol 10 mg l-1, suplementado con albúmina 14,4 μl ml-1 y DNasa tipo I 26 μl ml-1, pH 7,2, tripsina 10,8 μl ml-1), y se tripsinizó a 37 °C en baño termostatizado durante 5 min, agitando frecuentemente para evitar la decantación del tejido. Se desintegró mecánicamente mediante trituración usando una pipeta serológica de 5 ml cinco veces. Luego, la suspensión se devolvió al baño termostatizado durante 10 min, agitando frecuentemente. La actividad de la tripsina se detuvo añadiendo suero fetal al 10%, antes de centrifugar el tejido a 700 g durante 5 minutos en una microcentrífuga a 4 °C. Una vez decantado el tejido desintegrado enzimáticamente, el sedimento se resuspendió en una solución de desintegración libre de tripsina (EBSS + 13 μl ml-1 DNasa + 20 μl ml-1 albúmina) para su trituración mecánica utilizando una pipeta Pasteur. Se realizaron aproximadamente cinco pases por un volumen de 4 ml y por hemisferio. El sobrenadante se centrifugó durante 3 minutos a 700 gy se contó el número de células en el sedimento. Una vez que se logró una suspensión homogénea de células neurales adultas individualizadas, se realizaron separaciones de poblaciones celulares utilizando la tecnología MACS utilizando el kit de microperlas anti-ACSA-2 específico para astrocitos o el kit de aislamiento de neuronas específico para neuronas, de acuerdo con el protocolo del fabricante (tecnología MACS). ). Confirmamos la identidad de las fracciones aisladas mediante transferencia Western contra marcadores específicos astrocíticos (GFAP), neuronales (MAP2) y la pureza con marcadores específicos microgliales (Iba1) y oligodendrogliales (OLIG2).

Para los experimentos de eliminación de NDUFS1, utilizamos pequeños ARN de interferencia (siRNA) contra NDUFS1 (siNDUFS1; s105592; Life Technologies) y un control de siRNA (siControl; 4390843; Life Technologies). Las transfecciones con ARNip se realizaron con el reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando una concentración final de ARNip de 9 nM. Las células se utilizaron después de 3 días.

Para evaluar los flujos oxidativos de ácidos grasos, glucosa y piruvato, utilizamos enfoques radiométricos. Para hacer esto, se sembraron astrocitos en matraces de 8 cm2 de los que colgaba un tubo de microcentrífuga que contenía 1 ml de hidróxido de bencetonio (Sigma) (para equilibrar con 14CO2) o 1 ml de H2O (para equilibrar con 3H2O). Para los cortes de cerebro, estos se colocaron en matraces de vidrio de 25 ml que albergaban un pocillo central con un tubo que contenía 0,8 ml de hidróxido de bencetonio. Todas las incubaciones se llevaron a cabo en KRPG (NaCl 145 mM; Na2HPO4 5,7 mM; KCl 4,86 ​​mM; CaCl2 0,54 mM; MgSO4 1,22 mM; pH 7,35) que contenía d-glucosa 5 mM a 37 °C en la cámara termostatizada con aire de un orbital. criba vibradora. Para asegurar un suministro adecuado de oxígeno para el metabolismo oxidativo durante todo el período de incubación, las atmósferas de los matraces se gasearon con carburógeno (5% CO2/95% O2) antes de sellarlos con tapas de goma. Para medir el flujo de carbono de los ácidos grasos al CO2, se incubaron células (o cortes de cerebro) en tampón KRPG (glucosa 5 mM) con 0,25 µCi ml-1 de ácido palmítico [U-14C] o [1-14C] ( más ácido palmítico 10 µM)44, como se indica en las figuras. Para medir el flujo de carbono de la glucosa al CO2 a través del ciclo de TCA, las células se incubaron en KRPG (d-glucosa 5 mM) con 0,25 μCi ml-1 D-[6-14C]glucosa45. Para medir el flujo de carbono del piruvato al CO2 a través de la absorción mitocondrial de piruvato seguida de la actividad de PDH, las células se incubaron en KRPG (d-glucosa 5 mM) con 0,25 μCi ml-1 de piruvato [1-14C] (más piruvato 1 mM). Las incubaciones se terminaron después de 90 minutos mediante la adición de 0,2 ml de ácido perclórico al 20% (Merck Millipore) y, después de 60 minutos más, se usó el tubo que contenía hidróxido de bencetonio (con el 14CO2 atrapado) para determinar la radioactividad usando un analizador de centelleo líquido. (Tri-Carb 4810 TR, PerkinElmer). El flujo glucolítico se midió analizando la tasa de producción de 3H2O a partir de [3-3H]glucosa usando una estrategia similar usando 3 μCi ml-1 de d-[3-3H]glucosa en tampón KRPG (d-glucosa 5 mM) durante 120 mín. (ref. 45). Después de terminar las incubaciones con 0,2 ml de ácido perclórico al 20 %, las células se incubaron más durante 96 h para permitir el equilibrio de 3H2O con el H2O presente en el tubo de microcentrífuga central. Luego se midió el 3H2O mediante recuento de centelleo líquido (Tri-Carb 4810 TR, PerkinElmer). Para los cálculos se utilizó la radiactividad específica. En estas condiciones experimentales, se recuperaron y se tuvieron en cuenta para los cálculos el 75% del 14CO2 producido y el 28% del 3H2O producido45. Para evaluar la conversión de ácidos grasos en cetonas, se sembraron astrocitos en matraces de 8 cm2 con KRPG (glucosa 5 mM). La tasa de formación de cuerpos cetónicos se determinó añadiendo 0,25 µCi ml-1 de ácido palmítico [1-14C] unido a albúmina sérica bovina (BSA) deslipidada (más ácido palmítico 10 µM) durante 2 h. Después las incubaciones se terminaron con 0,2 ml de ácido perclórico al 20% (v/v). Los cuerpos cetónicos se extrajeron como un producto no volátil y soluble en ácido10. Para ello, se tomó 1 ml del medio y se añadió a un tubo de centrífuga deslipidado de 50 ml (352070; FalconTM) que contenía 8 volúmenes de una mezcla de cloroformo:metanol (2:1, v/v) y 2 volúmenes de KCl (0,1 METRO). Después de agitar, se centrifugó durante 5 min a 3000 g. La fase acuosa superior se tomó y se transfirió a otro tubo que contenía 8 volúmenes de mezcla de cloroformo:metanol (2:1 v/v). Después de agitar y centrifugar en las mismas condiciones, se tomó la fase acuosa superior y se transfirió a un vial de centelleo líquido para su recuento.

Las concentraciones de lactato se midieron espectrofotométricamente en el medio de cultivo45 mediante la determinación de los incrementos en la absorbancia de las muestras a 340 nm en una mezcla que contenía NAD+ 1 mM, 8,25 U de lactato deshidrogenasa en glicina 0,25 M, hidracina 0,5 M y ácido etilendiaminotetraacético 1 mM. Tampón (EDTA), pH 9,5.

Los astrocitos se incubaron durante 48 h en medio fresco, que se recogió y se congeló a -80 °C. El β-hidroxibutirato se determinó utilizando un kit de detección espectrofotométrico (MAK134, Sigma) en 40 µl de muestras siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los OCR de células en cultivo primario o recién aisladas inmunomagnéticamente se midieron en tiempo real en un analizador de flujo extracelular XFe24 (Seahorse Bioscience; software Seahorse Wave Desktop v.2.6.1.56). Este equipo mide los cambios en el flujo de O2 del medio extracelular de células sembradas en placas de 24 pocillos XFe. El medio celular regular se eliminó y se lavó dos veces con medio DMEM (ensayo XF modificado suplementado con glucosa 5 mM, l-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,4) y se incubó a 37 °C sin CO2 durante 30 min para permitir que las células se preequilibren con el medio de ensayo. Se cargaron oligomicina, FCCP (cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona) y una mezcla de rotenona y antimicina, diluidas en medio de funcionamiento DMEM, en el puerto A, el puerto B y el puerto C, respectivamente. Las concentraciones finales en microplacas de cultivo celular XFe24 fueron oligomicina 1 μM, FCCP 2 μM, rotenona 1 μM y antimicina 2,5 μM. La secuencia de mediciones fue la siguiente a menos que se indique lo contrario. El nivel basal de OCR se midió tres veces y luego se inyectó el puerto A y se mezcló durante 3 minutos, después de que se midió el OCR tres veces durante 3 minutos. Mismo protocolo con puerto B y puerto C. Se midió el OCR después de cada inyección para determinar la contribución mitocondrial o no mitocondrial al OCR. Todas las mediciones se normalizaron para promediar tres mediciones del nivel basal (inicial) de OCR celular de cada pocillo restando el OCR no mitocondrial. Cada muestra se midió en 3 a 5 réplicas. Los experimentos se repitieron de 3 a 5 veces en preparaciones de cultivos biológicamente independientes. La OCR no mitocondrial se determinó mediante OCR después de la inyección de antimicina más rotenona juntas o por separado. La respiración máxima se determinó mediante la tasa máxima de OCR después de la inyección de FCCP menos la OCR no mitocondrial. La producción de ATP se determinó mediante la última medición de OCR antes de la inyección de oligomicina menos la medición mínima de OCR después de la inyección de oligomicina. Cuando estaba indicado, se inyectó etomoxir (100 μM) en el puerto A para determinar la respiración dependiente de ácidos grasos, que se obtuvo restando el valor mínimo de OCR después de etomoxir al anterior a la inyección de etomoxir. Para estimar la respiración mitocondrial sostenida por CI, al OCR antes de la inyección de rotenona se le restó la medición mínima de OCR después de la inyección de rotenona, y luego de este valor se restó el OCR no mitocondrial. También determinamos la respiración sostenida con CI en células permeabilizadas. Para hacerlo, el tampón XF DMEM se cambió a tampón manitol y sacarosa (que contiene sacarosa 70 mM, manitol 220 mM, KH2PO4 10 mM, MgCl2 5 mM, HEPES 2 mM y EGTA 1 mM, pH 7,2) y se controló el nivel basal de OCR. Para evaluar la OCR en células permeabilizadas, se agregaron digitonina (25 µg ml-1), l-glutamina:malato (Gln:Mal; 4 mM:0,5 mM) y ADP (1 mM) para estimular la reducción de NAD+ y la respiración. Se agregaron rotenona y antimicina secuencialmente para calcular de forma independiente la respiración sostenida con CI y el OCR no mitocondrial. La respiración sostenida con CI se calculó como la diferencia entre la OCR después de digitonina/Gln/Mal/ADP y la OCR después de antimicina (OCR no mitocondrial).

Las células se recogieron y se suspendieron en tampón fosfato 10 mM (KH2PO4; pH 7,0). Después de tres ciclos de congelación y descongelación para garantizar la alteración celular, se determinaron las actividades específicas de CI, CI-III, CII-III, CIV y citrato sintasa. La actividad de CI sensible a rotenona (NADH-ubiquinona oxidorreductasa)46 se midió en KH2PO4 (25 mM, pH 7,2) en presencia de MgCl2 10 mM, 2,5 mg ml-1 de BSA, NADH 0,15 mM y KCN 1 mM. Se registraron cambios en la absorbancia a 340 nm (30 °C) (ε = 6,81 mM-1 cm-1) después de la adición de ubiquinona 50 µM y rotenona 10 µM. La actividad CI-III (NADH-citocromo c oxidorreductasa) se determinó en KH2PO4 (25 mM; pH 7,2) en presencia de MgCl2 10 mM, 50 mg ml-1 de BSA, KCN 300 mM y 330 mM de citocromo c oxidado. Se registraron cambios en la absorbancia (550 nm; 30 °C) (ε = 19,2 mM-1 cm-1) después de la adición de NADH 10 mM y antimicina A 10 µM más rotenona 25 µM. La actividad CII-III (succinato-citocromo c oxidorreductasa)47 se determinó en presencia de tampón fosfato 100 mM, más EDTA(K+ 0,6 mM), KCN 2 mM y citocromo c 200 µM. Se registraron cambios en la absorbancia (550 nm; 30 °C) (ε = 19,2 mM-1 cm-1) después de la adición de succinato 20 mM y antimicina A 10 µM. Para la actividad CIV (citocromo c oxidasa), el constante, k (min-1 mg de proteína-1) de oxidación del citocromo c se determinó48 en presencia de tampón fosfato 10 mM (KH2PO4; pH 7,0) y citocromo c reducido 50 µM; La absorbancia se registró cada minuto a 550 nm, 30 °C (ε = 19,2 mM-1 cm-1). La actividad de la citrato sintasa49 se midió en presencia de Tris-HCl 93 mM, Triton X-100 al 0,1% (v/v), acetil-CoA 0,2 mM y ácido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) 0,2 mM. (DTNB); la reacción se inició con 0,2 mM de oxalacetato y la absorbancia se registró a 412 nm (30 °C) (ε = 13,6 mM-1 cm-1). Los datos se expresaron como la relación de las actividades de cada complejo frente a la actividad de la citrato sintasa.

La actividad de PDH se determinó mediante la reducción de NAD+ a NADH, junto con la reducción de un colorante indicador para producir un producto de reacción coloreado con un aumento en la absorbancia a 450 nm a temperatura ambiente, utilizando el kit de ensayo de microplacas de actividad enzimática de PDH (Abcam, catálogo nº ab109902) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agregaron homogeneizados celulares (300 μg de proteína) a cada pocillo y la enzima PDH solubilizada se inmunocapturó durante 3 h. Después de lavar dos veces con estabilizador, se añadió solución de ensayo nueva y se midió la absorbancia de cada pocillo a 37 °C mediante un programa cinético a 450 nm durante 30 min con un intervalo de lectura de 60 s en un Varioskan Flash (Thermo Scientific). La actividad de PDH (μOD × min-1) se expresó como la velocidad de reacción inicial determinada a partir de las pendientes de las curvas generadas.

Las células se lisaron con 1% (p/v) de ácido sulfosalicílico, se centrifugaron a 13.000 g durante 5 minutos a 4 °C y los sobrenadantes se usaron para la determinación del glutatión total (es decir, glutatión reducido más el doble de la concentración de glutatión oxidado). glutatión), utilizando glutatión oxidado (0–50 µM) como estándar como se describió anteriormente50. El glutatión total se midió en tampón de reacción (NaHPO4 0,1 mM, EDTA 1 mM, DTNB 0,3 mM, NADPH 0,4 mM, glutatión reductasa 1 U ml-1, pH 7,5) registrando el aumento de la absorbancia después de la reacción del glutatión reducido con DTNB. durante 2,5 min a intervalos de 15 s utilizando un espectrofotómetro Varioskan Flash (Thermo Fisher) (λ = 405 nm). La concentración de glutatión (nmol mg-1 de proteína) se calculó a partir de las pendientes obtenidas en las muestras, extrapolándolas a las obtenidas en el estándar.

Para evaluar la eficiencia de transducción de la recombinasa Cre mediada por partículas adenovirales en cultivos de astrocitos primarios, las células se fijaron, se permeabilizaron utilizando el kit Fix&Perm (Becton Dickinson Biosciences) y se incubaron con anticuerpo anti-CPT1A (1/500) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con Cy5 durante 30 minutos a temperatura ambiente y se analizaron en el citómetro de flujo FACScalibur (láser de iones de argón de 15 mW; software CellQuest, Becton Dickinson Biosciences) utilizando canales FL1 y FL4 para el etiquetado GFP y CPT1A. respectivamente.

Las células se separaron cuidadosamente de las placas usando EDTA (sal tetrasódica) 1 mM en PBS (pH 7,4). Se utilizaron anexina-V conjugada con APC y 7-amino-actinomicina D (7-AAD) (Becton Dickinson Biosciences) para determinar cuantitativamente el porcentaje de neuronas apoptóticas mediante citometría de flujo. Las células se tiñeron con anexina-V-APC y 7-AAD en tampón de unión (HEPES 100 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 2,5 mM), según las instrucciones del fabricante, y se analizaron 5 x 104 células, en tres réplicas por condición. en un citómetro de flujo FACScalibur (láser de iones de argón de 15 mW; software CellQuest, Becton Dickinson Biosciences), utilizando canales FL4 y FL3, respectivamente. Las células anexina+ y 7-AAD- se consideraron apoptóticas. El umbral del analizador se ajustó en el canal del citómetro de flujo para excluir la mayoría de los desechos subcelulares y reducir el ruido de fondo debido a la alteración de las neuritas durante la separación neuronal. Los datos se expresaron como porcentajes.

Un hemisferio de ratones WT o CPT1A KO específicos de astrocitos de 12 meses de edad (n = 6 para cada condición) se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se usó para análisis metabolómicos no dirigidos (Metabolon Incorporated). El análisis de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas en tándem detectó 751 metabolitos. El servicio Metabolon extrajo los datos sin procesar, identificó los picos, procesó el control de calidad, los curó, los normalizó y transformó log2. Los picos se cuantificaron utilizando el área bajo la curva. Para estudios que abarcaron varios días, se realizó un paso de normalización de datos para corregir la variación resultante de las diferencias de sintonización entre días del instrumento. Básicamente, cada compuesto se corrigió en bloques de días de ejecución registrando las medianas para que fueran iguales a uno (1,00) y normalizando cada punto de datos proporcionalmente. Tras la imputación de los valores faltantes con el valor mínimo observado para cada compuesto, se utilizaron las pruebas t de dos muestras de Welch para identificar compuestos significativamente diferentes entre los grupos experimentales. Al utilizar estos filtros, aceptamos una estimación alta de la tasa de descubrimiento falso (valor q ≤ 0,50), aunque se implementaron otras consideraciones para determinar si un resultado merecía un mayor escrutinio. Dicha evidencia incluyó (1) relevancia biológica dado el contexto genético; (2) inclusión en una vía común con un compuesto muy significativo; (3) residir en una familia bioquímica funcional similar con otros compuestos importantes o (4) correlación con otros enfoques experimentales. Los gráficos correspondientes al análisis estadístico se realizaron con GraphPad v.8.0 y la herramienta online MetaboAnalyst v.5.0.

Las muestras de proteínas se cuantificaron mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo) utilizando BSA como estándar.

Las células se lisaron en tampón RIPA (dodecilsulfato de sodio al 1 %, EDTA 10 mM, Triton X-100 al 1 % (vol/vol), NaCl 150 mM y Na2HPO4 10 mM, pH 7,0), suplementado con una mezcla de inhibidor de proteasa (Sigma), 100 Inhibidores de fosfatasa y fluoruro de fenilmetilsulfonilo μM (O-vanadato 1 mM). Las muestras se hirvieron durante 5 min. Se sometieron alícuotas de lisados ​​​​celulares (40 μg de proteína) a SDS-PAGE en un gel de acrilamida de 8 a 12% (vol / vol) (MiniProtean; Bio-Rad), incluida la escalera de proteínas preteñida PageRuler (Thermo). Las proteínas resueltas se transfirieron electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa (0,2 µm, Bio-Rad). Las membranas se bloquearon con leche baja en grasa al 5 % (peso/vol) en TTBS (Tris 20 mM, NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,1 % (vol/vol), pH 7,5) durante 1 h. Después del bloqueo, las membranas se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Después de la incubación con IgG-HRP de cabra anticonejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (1/10.000, Santa Cruz Biotechnologies), IgG-HRP de cabra antirratón (1/10.000, Bio-Rad), IgG-HRP de conejo anticabra (1/10.000, Abcam) o IgG-HRP de cabra anti-ratón (1/10.000, Abcam) Las membranas anticonejo IgG-HRP (1/3000, Bio-Rad) se incubaron inmediatamente con el kit de quimioluminiscencia mejorado WesternBright ECL (Advansta) o Supersignal West Femto (Thermo) antes de la exposición a la película Fuji Medical X-Ray (Fujifilm) o usando el transiluminador Fusion FX (Vilber GmbH). Las abundancias de proteínas de todas las transferencias Western por condición se midieron mediante densitometría de las bandas, en la fase lineal de la exposición sin alcanzar la saturación, en las películas o en los autorradiogramas escaneados utilizando el software ImageJ v.1.48. Siempre se realizaron al menos tres réplicas biológicamente independientes, aunque en las figuras principales normalmente solo se muestra una transferencia Western representativa.

La inmunotransferencia se realizó con anti-CPT1A (1/1000) (ab128568; Abcam), anti-CPT1B (1/1000) (ab134988; Abcam), anti-CPT1C (1/1000) (ab87498; Abcam), anti-CTP2 ( 1/1000) (ab181114; Abcam), proteína anti-choque térmico-60 (HSP60) (1/1000) (ab46798; Abcam), anti-TOMM20 (1/1000) (ab56783; Abcam), anti-NDUFS1 ( 1/500) (sc-50132; Santa Cruz Biotechnology), anti-UQCRC2 (1/1.000) (ab14745; Abcam), anti-GFAP (1/500) (G6171; Sigma), anti-NDUFB8 (1/1.000) (ab110242; Abcam), anti-NDUFA9 (1/1.000) (ab14713; Abcam), anti-SDHA (1/1.000) (ab14715; Abcam), anti-MTCO1 (1/1.000) (ab14705; Abcam), anti- COX IV (1/1.000) (ab16056; Abcam), anti-Iba1 (1/1.000) (019-19741; Wako), anti-MAP2 (1/1.000) (ab32454; Abcam), anti-OLIG2 (1/1.000 ) (ab109186; Abcam), anti-PDHA1 (1/1.000) (n.º 3205; Señalización celular), anti-fosfoSer293-PDHA1 (1/1.000) (n.º 31866; Señalización celular), anti-β-tubulina III ( 1/300) (T2200; Sigma) y anti-β-actina (1/30.000) (A5441; Sigma).

Para obtener la fracción mitocondrial, los sedimentos celulares se congelaron a -80 ° C y se homogeneizaron (10 a 12 golpes) en un homogeneizador Potter-Elvehjem de vidrio y teflón en tampón A (sacarosa 83 mM y MOPS 10 mM; pH 7,2). Se añadió a la muestra el mismo volumen de tampón B (sacarosa 250 mM y MOPS 30 mM) y el homogeneizado se centrifugó (1000 g, 5 min) para eliminar las células y los núcleos intactos. Luego se realizó la centrifugación del sobrenadante (12.000 g, 3 min) para obtener la fracción mitocondrial, que se lavó en tampón C (sacarosa 320 mM; EDTA 1 mM y Tris-HCl 10 mM; pH 7,4)18. Las mitocondrias se suspendieron en tampón D (ácido 6-aminohexanoico 1 M y Bis-Tris-HCl 50 mM, pH 7,0).

Para la evaluación de la organización del complejo I, se cargaron mitocondrias solubilizadas con digitonina (4 g g-1) (10–50 μg) en geles NativePAGE Novex 3–12% (vol/vol) (Life Technologies). Después de la electroforesis, se evaluó la actividad NADH deshidrogenasa en gel, lo que permitió la identificación del complejo I individual y de las bandas SC que contienen el complejo I debido a la formación de púrpura precipitado en la ubicación del complejo I (ref. 18). Brevemente, los geles se incubaron en 0,1 M de tampón Tris-HCl (pH 7,4), 1 mg ml-1 de nitro azul de tetrazolio y 0,14 mM de NADH. A continuación, se realizó una electrotransferencia directa seguida de una inmunotransferencia contra el anticuerpo NDUFS1 del complejo I mitocondrial y el anticuerpo UQCRC2 del complejo III. La transferencia directa de BNGE se realizó después de remojar los geles durante 20 minutos (4 °C) en tampón carbonato (NaHCO3 10 mM; Na2CO3 · 3 mM · 10H2O; pH 9,5–10). La transferencia de proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno se llevó a cabo a 60 V durante 90 minutos a 4 °C en tampón carbonato.

Las ROS mitocondriales se determinaron con la sonda fluorescente MitoSox (Life Technologies). Se incubaron células cultivadas o suspensiones de células cerebrales adultas con MitoSox 2 μM durante 30 minutos a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5% en solución salina tamponada de Hank (NaCl 134,2 mM, KCl 5,26 mM, KH2PO4 0,43 mM, NaHCO3 4,09 mM, Na2HPO4·2H2O 0,33 mM, glucosa 5,44 mM, HEPES 20 mM y CaCl2·2H2O 20 mM, pH 7,4). Luego, las células se lavaron con PBS (NaCl 136 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO4·2H2O 7,8 mM; KH2PO4 1,7 mM; pH 7,4) y se recogieron mediante tripsinización. La intensidad de la fluorescencia de MitoSox se evaluó mediante citometría de flujo (citómetro de flujo FACScalibur, BD Biosciences) y se expresó en unidades arbitrarias.

Para las evaluaciones de H2O2 se utilizó AmplexRed (Life Technologies). Las células se tripsinizaron y se incubaron en tampón KRPG (NaCl 145 mM, Na2HPO4 5,7 mM, KCl 4,86 ​​mM, CaCl2 0,54 mM, MgSO4 1,22 mM, glucosa 5,5 mM, pH 7,35) en presencia de AmplexRed 9,45 μM que contenía 0,1 U ml-1 de rábano picante. peroxidasa. La luminiscencia se registró durante 2 h a intervalos de 30 min utilizando un Varioskan Flash (Thermo Scientific) (excitación, 538 nm; emisión, 604 nm). Se utilizaron pendientes para calcular las tasas de formación de H2O2.

El potencial de membrana mitocondrial (Δψm) se evaluó con MitoProbe DilC1 (5) (Life Technologies) (50 nM) mediante citometría de flujo (citómetro de flujo FACScalibur, BD Biosciences) y se expresó en unidades arbitrarias. Para ello, se incubaron suspensiones celulares con la sonda durante 30 minutos a 37 °C en PBS. Los Δψm se obtienen después de restar el valor potencial determinado en presencia de cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (CCCP) (10 µM, 15 min) para cada muestra.

Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de xilazina (Rompun; Bayer) y clorhidrato de ketamina:clorbutol (Imalgene; Merial) (1:4, v/v) a 1 ml por kg de peso corporal y luego se perfundieron intraaórticamente con NaCl al 0,9% para eliminar las células sanguíneas. Después de la perfusión, los cerebros se diseccionaron sagitalmente en dos partes y se fijaron posteriormente con Somogyi (4% (peso/vol) de paraformaldehído y 10% (vol/vol) de metanol, en solución tampón de fosfato 0,1 M; pH 7,4) durante 96 h a 4°C. C. Los bloques cerebrales se enjuagaron tres veces con solución tampón fosfato 0,1 M y se crioprotegieron en sacarosa al 10, 20 y 30% (p/v) en solución tampón fosfato secuencialmente, hasta que se hundieron. Después de la inmersión en un medio de temperatura de corte óptima y la congelación durante al menos 24 h, se obtuvieron secciones sagitales de 30 μm de espesor con un criostato deslizante de congelación (Leica). Para la inmunohistoquímica, las secciones se incubaron secuencialmente en (1) 5 mg ml-1 de borohidruro de sodio en solución tampón fosfato durante 30 minutos (para eliminar la autofluorescencia del aldehído); (2) tres lavados con PBS de 10 minutos cada uno; (3) 1/5000 anti-GFP (ab290; Abcam) en Triton X-100 al 0,02 % (Sigma) y suero de cabra al 5 % (Jackson Immuno-Research) en solución tampón fosfato 0,1 M durante 72 h a 4 °C; (4) tres lavados con solución tampón fosfato de 10 minutos cada uno; (5) anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo 1/500 Cy2 anticonejo de cabra (Jackson Immuno-Research) en solución tampón fosfato durante 2 h a temperatura ambiente y (6) 0,5 μg ml-1 de 4,6-diamidino-2-fenilindol en tampón fosfato solución durante 10 min a temperatura ambiente. Después de enjuagarse con solución tampón fosfato, las secciones se montaron con medio de montaje acuoso Fluoromount (Sigma) y cubreobjetos (Thermo Fisher). Las secciones se examinaron con epifluorescencia y los juegos de filtros apropiados bajo un sistema de imágenes de alto contenido Operetta CLS (PerkinElmer). Las imágenes de alta resolución se adquirieron utilizando un objetivo OperaPHX/OPRTCLS Air Objective × 20 hNA.

Los ratones (1 a 9 meses después de las inyecciones de AAV, es decir, de 3 a 12 meses de edad) se dejaron aclimatar en la habitación durante no menos de 15 minutos en el mismo intervalo de tiempo del día (14:00 a 20:00). El seguimiento se llevó a cabo una vez a la vez y se limpió cuidadosamente el aparato con etanol al 70% entre pruebas para eliminar cualquier señal de olor. Se utilizó un núcleo de caja ANY, que contenía una base gris claro y un palo perpendicular ajustable que sostenía una cámara y un conjunto de haces fotográficos infrarrojos para rastrear el movimiento del animal y detectar el comportamiento de crianza, respectivamente. Los movimientos del ratón se rastrearon con el software ANY-maze y la interfaz AMi-maze para registrar todos los parámetros que se describen a continuación. Para la prueba de campo abierto, se utilizó un inserto de metacrilato transparente infrarrojo negro de 40 × 40 × 35 cm (ancho, profundidad, altura) y la arena se dividió en tres zonas, a saber, el borde (8 cm de ancho), el centro (16% del área total) e intermedia (el área restante). La prueba tuvo una duración de 10 min y se midió la distancia recorrida, el número de crías y el tiempo de permanencia en cada zona. Se utilizó una prueba Rotarod (aparato Rotarod, modelo 47600, Ugo Basile) para analizar el equilibrio y la coordinación motores. Los ratones fueron previamente entrenados durante tres días consecutivos, 2 días antes de la prueba. Las condiciones del rotarod fueron una aceleración gradual de 4 a 25 rpm, alcanzando la velocidad final a los 270 s. Para analizar la memoria a corto plazo, utilizamos la novedosa prueba de reconocimiento de objetos (Stoelting) en un núcleo de 40 × 40 × 35 cm (ancho, profundidad, altura) con inserto de metacrilato transparente infrarrojo negro, también rastreado con el software ANY-maze y la interfaz AMi-maze para registrar el seguimiento de los ratones. Los ratones se acostumbraron a este ambiente durante 10 min durante dos días consecutivos y la prueba se realizó al tercer día. Se dejó que los ratones exploraran dos cubos equidistantes idénticos durante 5 minutos (la fase de familiarización) y se regresaron durante 30 minutos a su jaula. Se sustituyó un cubo por una esfera de tamaño y color similar y los ratones fueron devueltos a la arena para explorar los objetos durante otros 5 minutos (la fase de prueba). Para puntuar entradas de zona que consideran la exploración de un objeto, consideramos el tamaño del objeto (3,8 × 3,8 cm) y el perímetro circundante (6 × 6 cm). La capacidad de reconocer la esfera como un objeto novedoso se determinó como el índice de discriminación (DI), que se calculó como DI = (TN − TF)/(TN + TF), donde TN es el tiempo dedicado a explorar el nuevo objeto (esfera ) y TF es el tiempo dedicado a explorar el objeto familiar (cubo). Para la prueba del laberinto de Barnes utilizamos un equipo formado por una plataforma circular gris (120 cm de diámetro elevada 90 cm del suelo). A lo largo de su perímetro había 20 agujeros equidistantes. El laberinto tiene una caja de escape extraíble que se puede colocar debajo de cualquiera de los agujeros y se llena con la cama de los animales antes de cada experimento. Se utilizaron imágenes estampadas en blanco y negro como señales visuales espaciales. Todas las sesiones se realizaron bajo una iluminación ambiental de 400 lux para aumentar la aversión del mouse hacia la plataforma. La prueba constó de tres fases. La primera es la fase de habituación, donde se dejó a los animales explorar la plataforma libremente durante 5 minutos 1 día antes de las sesiones de entrenamiento. Posteriormente, los animales pasaron por la fase de entrenamiento donde se les permitió ubicar el orificio de escape por un máximo de 5 min, durante 3 días con cuatro sesiones por día. Finalmente, para la fase de sonda, se evaluó la memoria espacial de los ratones. En esta sesión se quitó la caja de escape y la plataforma se dividió virtualmente en cuatro cuadrantes, cada uno con cinco agujeros. Se permitió a los ratones explorar el laberinto durante 5 minutos y se cuantificó el tiempo pasado en el cuadrante que previamente contenía la caja de escape. El número de animales evaluados por ensayo se especifica en las leyendas de las figuras (8 ≥ n ≤ 13).

Para comparaciones simples, utilizamos una prueba t de Student de dos colas no pareada y, eventualmente, una prueba t de Student múltiple no pareada, excepto para (1) Fig. 2e-h y (2) Fig. 3h,l, en las que utilizamos Prueba t de Student pareada (bilateral) porque (1) cada preparación de cultivo primario y experimento se realizaron en un día diferente, y (2) en estos experimentos, las neuronas se obtuvieron de la misma preparación y luego se expusieron a dos tipos de inserto (los que contienen WT y los que contienen astrocitos CPT1A KO). Para otras comparaciones de valores múltiples, utilizamos el análisis de varianza bidireccional (ANOVA) seguido de pruebas de Tukey. Todas las pruebas utilizadas están indicadas en la leyenda de cada figura. El análisis estadístico se realizó mediante el software GraphPad Prism v.8. El número de preparados de cultivo biológicamente independientes o de animales utilizados por experimento se indica en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos la asistencia técnica de M. Resch, M. Carabias-Carrasco, L. Martin y E. Prieto-García. Este trabajo fue financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional, Agencia Estatal de Investigación (subvenciones n.º PID2019-105699RB-I00/AEI/10.13039/501100011033 y RED2018‐102576‐T a JPB y SAF2017-90794-REDT a AA), Instituto de Carlos III Sanidad (subvención nº CB16/10/00282 a JPB y PI18/00285 y RD16/0019/0018 a AA), Junta de Castilla y León (subvención nº CS/151P20) y Escalera de Excelencia (subvención nº CLU) -2017-03 a JPB y AA).

Estos autores contribuyeron igualmente: Brenda Morant-Ferrando, Daniel Jiménez-Blasco.

Instituto de Biología Funcional y Genómica (IBFG), Universidad de Salamanca, CSIC, Salamanca, España

Brenda Morante-Ferrando, Daniel Jimenez-Blasco, Paula Alonso-Batán, Jesús Agulla, Rebeca Lapresa, Dario García-Rodriguez, Sara Yunta-Sanchez, Irene López-Fabuel, Emilio Fernandez, Angeles Almeida, Marina García-Macia & Juan P. Bolaños

Instituto de Investigaciones Biomédicas de Salamanca (IBSAL), Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, España

Brenda Morante-Ferrando, Daniel Jimenez-Blasco, Paula Alonso-Batán, Jesús Agulla, Rebeca Lapresa, Dario García-Rodriguez, Sara Yunta-Sanchez, Irene López-Fabuel, Emilio Fernandez, Angeles Almeida, Marina García-Macia & Juan P. Bolaños

Centro de Investigaciones Biomédicas en Red sobre Fragilidad y Envejecimiento (CIBERFES), Madrid, España

Daniel Jimenez-Blasco, Emilio Fernandez, Marina Garcia-Macia & Juan P. Bolaños

Laboratorio de Angiogénesis y Metabolismo Vascular, Centro de Investigación Vesalius, Lovaina, Bélgica

Peter Carmeliet

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JPB concibió la idea. JPB, MG-M. y AA diseñaron la investigación. BM-F., MG-M., DJ-B., PA-B., JA, DG-R., SY-S., RL, IL-F. y EF realizó una investigación. JPB, MG-M., BM-F., DJ-B., AA, JA, DG-R., RL, IL-F. y EF analizaron los datos. Materiales aportados por PC. JPB escribió el manuscrito. Todos los coautores editaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondence to Angeles Almeida, Marina Garcia-Macia or Juan P. Bolaños.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Metabolism agradece a Manuel Guzmán y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Alfredo Giménez-Cassina, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

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Reimpresiones y permisos

Morant-Ferrando, B., Jiménez-Blasco, D., Alonso-Batán, P. et al. La oxidación de ácidos grasos organiza supercomplejos mitocondriales para sostener las ROS astrocíticas y la cognición. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00835-6

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Recibido: 29 de noviembre de 2022

Aceptado: 02 de junio de 2023

Publicado: 17 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00835-6

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Metabolismo de la naturaleza (2023)